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分析研究猫白血病病毒的检测和及pol基因遗传进化现状

2020-07-08 490 上传者：管理员

摘要：为调查猫白血病病毒(FeLV)在青岛地区的流行情况,对2018年—2019年在青岛地区动物医院采集的25份临床疑似患有猫白血病的病料进行FeLV的RT-PCR检测,并对阳性样品的PCR产物进行了测序和遗传进化分析。结果表明,25份样品中14份检测为FeLV阳性,检出率为56%,检出率较高。同源性分析表明,除4株毒株同源性为100%外,其余各毒株间同源性差异较大,在85.5%～99.6%之间,各毒株间发生了一定变异。遗传进化分析表明,13株毒株独自形成一个分支,与来自中国台湾的FeLV-TWK30毒株遗传进化关系较远。可见猫白血病病毒在青岛地区的感染已较为严重,加强监测及防疫已经刻不容缓。

关键词：
恶性淋巴瘤
检测
猫
猫白血病病毒
遗传进化分析
预防兽医学
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猫白血病(Feline leukaemia,FeL)是由猫白血病病毒(Feline leukaemia virus,FeLV)引起的一种以恶性淋巴瘤为特征的传染病,全身淋巴系统恶性肿瘤,免疫系统极度抑制和骨髓造血器官破坏性贫血是猫白血病的主要特征。1964年,Jarrett W F等[1]首次发现猫白血病病毒。同年,猫淋巴瘤病毒的传播在《Nature》杂志上有了第一次报道。这一开创性发现开启了对猫白血病病毒的研究,猫逆转录病毒学的研究领域也被打开[2]。FeLV属逆转录病毒科、肿瘤病毒亚科、C型肿瘤病毒属、哺乳动物C型病毒亚属,为有囊膜的单链RNA病毒,有FeLV-A、FeLV-B、FeLV-C和FeLV-T 4个亚型[3]。猫科动物中最常见的是FeLV-A亚型,FeLV-A最具传染性,可建立持久的病毒血症,但毒性最低。FeLV病毒基因组含有3个编码结构蛋白的基因,即gag、pol和env。其中,gag编码结构蛋白,pol编码逆转录酶,env编码病毒糖蛋白,3个基因按5′-gag-pol-env-3′次序排列[4]。

FeLV在全世界范围内流行,然而,患病率因地区、年龄、健康状况和人口密度等的不同而有很大差异。在不同的国家和地区,猫的生活方式和免疫时间的不同将会导致猫白血病流行的差异[5]。本试验通过对25份青岛地区的疑似猫白血病的临床样本进行PCR检测,并进行测序和遗传进化分析。通过实验室检查了解猫白血病的感染情况及病毒的变异情况,为临床上防治猫白血病及后续对FeLV病毒学的深入研究提供一定参考。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1病料来源

25例临床样本来自2018年—2019年青岛地区动物医院,具有消瘦、贫血、饮食减少和精神沉郁等症状的疑似感染白血病的猫的口鼻拭子和肛拭子(其中19份口鼻分泌物,6份粪便)。

1.1.2主要试剂

One Step RT-PCR Kit一步法反转录PCR试剂盒,诺唯赞生物科技(南京)有限公司产品;病毒核酸提取试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司产品;6×Loding Buffer、DNA标准DL 2 000,宝日医生物技术(北京)有限公司产品。

1.1.3仪器设备

BSC-1100-LIA2生物安全柜,东联哈尔仪器制造(北京)有限公司产品;SIGMA 3K15离心机,Sigma(德国)公司产品;K8360全自动凝胶成像系统,科创锐新生物科技(北京)有限公司产品;T100PCR仪,Bio-Rad(美国)公司产品;PowerPac Basic核酸电泳仪,北京六一仪器厂产品。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成

根据Ramírez H等的报道[6],选择FeLV的pol基因设计引物,上游引物FeL-Pol-F:TGAATGTCCCTACCCGTT,下游引物FeL-Pol-R:GGATGGATGTCCTCTACCC,目的片段为601 bp,由青岛擎科生物公司合成。

1.2.2临床样品的RT-PCR检测

按照博日科技(杭州)有限公司的Simply P病毒DNA/RNA提取试剂盒产品说明书进行。使用诺唯赞一步法试剂配制25μL的反应体系,以提取的核酸为模版,进行RT-PCR扩增,反应条件为:反转录,50℃30min;预变性94℃3 min;94℃30 s,52.5℃30 s,72℃1 min,35个循环;72℃7 min。PCR产物于凝胶成像仪下观察并记录结果。PCR检测阳性产物送至青岛擎科生物公司测序。

1.2.3 PCR产物的分子生物学分析

运用MegAlign、Mega5等软件,对PCR产物的测序结果进行同源性分析和遗传进化分析。

2、结果

2.1临床样本RT-PCR检测结果

25份样品进行RT-PCR检测,共检测出FeL阳性样品14份,检出率为56%(14/25),12个公猫样本中阳性6个,13个母猫样本中阳性8个(表1)。将14份RT-PCR检测阳性的产物送往测序,将测序成功的13个序列在NCBI上进行BLAST比对,所测序列与BLAST上FeLV参考株相似度为100%,表明检测到的样本为猫白血病病毒。

2.2同源性分析

由图1可见,4个毒株YD-44、YD-50、YD-54、YD-66之间的核苷酸的同源性为100%;其他毒株之间核苷酸的同源性较低,在85.5%～99.6%之间,说明本试验涉及到的毒株相互之间的核苷酸同源性差异较大。

2.3遗传进化分析

使用Mega5软件,选取部分参考毒株(表2,图2)绘制遗传进化树,结果显示,本试验涉及到的13株毒株形成了一个独立分支,与FeLV-MG1、FeLV-TWK25、FeLV-K01803、FeLV-Rickard、FeLV-914MG、FeLV-328MG、FeLV-FAIDS、FeLV-887MG毒株处于分于2个小分支,提示其遗传进化关系较近。而FeLV-TWK30处于第3个不同的分支上,遗传进化关系相对较远。

表1临床样本检测结果

图1 FeLV基因核苷酸同源性比对结果

表2参考毒株

图2 FeLV毒株遗传进化分析

3、讨论

猫白血病病毒主要侵害猫科动物,家猫是主要宿主,4月龄以下的幼猫最易感。受到感染的猫不论性别和品种的异同90%以上终身携带病毒,大多数感染病毒的猫会在2年～3年内死亡。FeLV既可水平(由分泌物和排泄物)传播,也可(子宫内)垂直传播[7]。本病在猫之间主要以水平传播的方式感染其他猫,例如相互撕咬、抓挠都可造成感染[8]。感染猫的唾液中多含有高浓度的病毒,其次在乳汁和鼻液中也含有病毒,并能通过唾液和尿液向体外排毒,但病毒在宿主外不能存活很长时间[9]。本试验采集临床患病猫的口鼻拭子进行FeLV的RT-PCR检测,结果显示,青岛地区疑似患病猫中的FeLV阳性检出率为56%,检出率较高,说明猫白血病的感染已较为广泛。同源性分析表明,除4株核苷酸同源性为100%外,其余各毒株间核苷酸同源性差异较大,在85.5%～99.6%之间,说明各毒株间发生一定变异。遗传进化分析13个毒株独自形成一个分支,与来自中国台湾的FeLV-TWK30毒株遗传进化关系较远。

研究显示,某些动物包括人类的白血病也是由白血病毒引起的,并且猫白血病与人类白血病在很多方面存在相似之处,例如,两者的潜伏期时长和对免疫系统的作用效果十分相近[10],猫白血病病毒可产生的几种蛋白质与人类白血病患者血液中发现的蛋白质类似,因此,猫白血病与人类白血病存在着诸多的相似之处,可作为人类白血病的研究模型,在研究上相互借鉴[11]。由于FeLV已被认为是引起家猫严重疾病和死亡的一种重要的致病因素,大型猫科动物之间极易发生撕咬、打斗之类的行为,导致了现阶段无论是野生生活还是笼舍饲养的猫科动物的FeLV感染率均居高不下[12]。约有1%～2%类似健康的流浪猫隐性带毒,这些流浪猫可能充当了FeLV的主要贮藏宿主,从唾液、尿液、粪便及眼泪中排出FeLV,成为病毒扩散的主要途径[7]。但目前对FeLV尚无有效的预防方法,因此,对各地区的猫科动物加强检疫,淘汰感染猫,加强对流浪猫的管理和防疫措施,重视对猫白血病的研究,已经成为刻不容缓的课题。本试验为青岛地区FeLV的流行情况以及了解该地区FeLV的遗传变异情况提供了试验数据,为后续FeLV病毒学研究提供参考。

参考文献：

[4]吕晓萍,郑琪,邵悦,等.猫白血病病毒分子致病机制研究进展[J].中国畜牧兽医,2010,37(3):189-191.

[7]翁善钢.猫白血病的流行病学及诊治技术[J].浙江畜牧兽医,2012(1):40-41.

[8]王久成,潘美乔,魏美华,等.猫白血病( FeL)的诊断和防治现状[J].黑龙江畜牧兽医,2016(14):195-197.

[10]朱易萍,李钦伯.人类猫白血病病毒受体的研究进展[J].国外医学:.输血及血液学分册,2005(4):295-297.

[11]常盛.猫白血病疫苗[J].国外医学情报,1982(18):319.

刘雪娇,崔燕蕾,李子荷,柳婷婷,杨海燕,单虎,张传美.猫白血病病毒的检测及pol基因遗传进化分析[J].动物医学进展,2020,41(07):34-37.

基金:国家重点研发计划项目子课题(2016YFD0501004);青岛农业大学2019年大学生创新创业训练项目.