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薄层色谱技术在中兽药鉴别中的影响因素分析

2024-08-15 45 上传者：管理员

摘要：近年来，薄层色谱在中兽药的分析和检验中的应用越来越广泛，为中兽药的真假和优劣提供了判断依据，但在实验过程中，发现供试品溶液黏性、点样方式、温度、相对湿度、蒸气溶剂、显色剂和操作等会对薄层色谱产生影响。本文对这些问题产生的原因进行分析，并提出相应的解决措施，为薄层色谱鉴别在中兽药材及成方制剂的分析和检验中的应用提供指导。

关键词：
中兽药
中兽药材
成方制剂质量标准
薄层色谱
鉴别检验
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薄层色谱鉴别是研究和控制中兽药材及中兽药成方制剂质量标准的重要手段之一。其具有灵敏度高、专属性强、可比性好和方便操作等特点。但在利用薄层色谱技术对中兽药材和成方制剂进行鉴别检验时，比较容易出现精密度差以及重现性不足等问题，从而在一定程度上降低了检验结果的准确性，给结果的判断带来困难[1]。因此，我们分析影响薄层色谱的因素，并提出相应的解决对策，以提高中兽药材和成方制剂薄层色谱鉴别检验结果的准确性。

1、基本方法及原理

薄层色谱法（TLC,thin-layer chromatography）是将固定相吸附剂均匀地涂在玻璃板上制成薄层板。试样中的各组分在固定相和作为展开剂的流动相之间不断地发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配过程。不同物质上升的距离不同而形成彼此分开的斑点从而达到分离的目的[2]。通过查看同一个薄层色谱上是否存在斑点，以及对斑点的位置和颜色进行对比，能够准确判断中兽药材和成方制剂的真伪，并且斑点颜色深浅程度、大小等也能在一定程度上反映出药品的优劣。

2、影响因素分析及对策

2.1 供试品溶液的黏性问题

第一种情况：因有蔗糖和糊精的影响，用溶剂提取后再经过水浴蒸干，之后加入适量的溶剂溶解后，供试品溶液的黏性会变得非常高。这时不但用点样针很难吸取溶液，而且点在薄层板上后，也很难吸附在薄层板的硅胶上。不管是手动点样还是仪器点样，都能看到供试品溶液如叶子上的露珠一般贴在硅胶上。这种情况违背了薄层色谱的原理。第二种情况：对照溶液和供试品溶液点在薄层板上后，溶液溶解在硅胶上，但是受蔗糖和糊精的影响，所用的展开剂不能带动斑点沿着薄层板上行，导致实验失败。第三种情况：因为对照溶液没有蔗糖和糊精的干扰，能够随着展开剂逐渐上行，但是爬行速度慢，所以斑点的位置会低于对照溶液。这将对结果的判断产生影响，降低了结果的准确性。以板青颗粒的薄层鉴别为例，在同一个薄层板上，精氨酸对照品的斑点位置高于供试品的位置，如图1所示，1为对照品，2～5为供试品。

图1 精氨酸对照品与供试品斑点位置对比

解决对策：一是简化供试品溶液的提取过程，如液体剂型尽量加有机溶剂稀释，颗粒剂尽量加入有机溶剂溶解，过滤；二是根据所提取成分的极性来选择提取溶液，同时还要考虑蔗糖和糊精的影响因素；三是在供试品溶液黏度略高的情况下，建议控制点样量，一般尽量不超过5μL，这样可以解决样品比较黏稠，点样量又相对比较大时可能出现斑点拖尾以及变形等问题[3]。

2.2 点样方式的影响

1）手动点样。当点样量小于5μL时，可以选用定量毛细管，当点样量在5～20μL时，可以选用微量注射器。手动点样应少次多量地将溶液点到薄层板上，如果上一次点的溶液没有干透，又继续在薄层板的同一个位置点溶液，就会让斑点越来越大，进而产生拖尾等现象。《中国兽药典》（2020版）二部关于点样的规定是：圆点一般不大于4 mm，高效板一般不大于2 mm，所以采用手动点样时，不仅要少量多次，还要注意圆点的大小，要尽可能地使每次点样的中心重合，并且在点样过程中不要因为多次点样而把硅胶表面划伤和刮破。

2）仪器点样。选用半自动点样仪或全自动点样仪，设定好单次的点样量，通过连通的氮气吹干斑点，这样点在薄层板上的斑点规整且一致。此外，实验人员可以根据实验的要求和供试品溶液的状态来选择斑点形状和长短，包括条带状斑点的长度和宽度。

2.3 温度的影响

展开时温度的改变首先会影响Rf值，其次影响分离度，严重时甚至导致分离失败[4]。温度会影响展开剂中有机溶剂在硅胶上的爬行速度。特别是在分配层析中，温度直接影响分配系数，并影响展开剂中溶剂的组成比例。而有机相中水的含量会随着温度的改变而发生明显变化。展开温度相差较大会对薄层色谱的质量产生不同程度的影响如图2所示。

图2 不同温度对薄层色谱展开的影响

从图2所显示的结果可以看出，温度对薄层色谱展开的影响是非常明显的，不容忽视。对于温度的影响，我们可以通过加热或制冷设备来控制实验环境的温度保持恒定。

2.4 相对湿度的影响

相对湿度主要影响的是薄层板的吸附能力。把活化后的薄层板从干燥器中取出，从点样到展开的整个过程中，薄层板都是直接裸露在实验室的环境中，因此薄层板的活性很大程度上取决于实验室空气的相对湿度。通常薄层板的重现性差不仅与实验方法有关，还与操作环境的相对湿度密切相关。在其他条件基本相同的情况下，相对湿度对薄层色谱展开的影响是显而易见的。这不仅体现在不同实验室之间，即使在同一实验室内，不同季节的湿度变化也可能导致结果的差异。因此，我们要采取适当的措施来控制实验环境的相对湿度。例如，在双槽展开缸的一侧放入适当浓度的硫酸溶液，再将薄层板放在另一侧的槽中，密闭放置15～30 min，然后立即将薄层板放置在有展开剂的一侧进行展开。全自动展开设备一般采用的是饱和盐溶液来调节和控制相对湿度的恒定。

2.5 溶剂蒸气的影响

薄层色谱展开剂的蒸气相在展开缸中也参与色谱展开，它和液相（展开剂）、固定相（吸附剂）一起构成了一个三维层析过程。薄层色谱的展开方式分为三种：1）在展开缸中加入展开剂后直接放入薄层板展开的；2）展开剂（或规定的溶剂）蒸汽在展开缸中预平衡一定时间再行展开的；3）展开剂（或规定的溶剂）蒸气在展开缸中达到饱和后再展开的。因此，溶剂蒸气在薄层色谱展开中起着重要的作用。例如，黄连解毒散中黄连生物碱的薄层鉴别属于展开方式的第三种情况，其展开剂为环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)[5]，其中浓氨溶液实际上起着双重作用。若氨是以蒸气相在薄层板上预吸附参与生物碱的分离，在液相（展开剂）中起作用的是水；若氨蒸气浓度不够，则分离度明显降低；若展开前不用氨蒸气预饱和而直接展开，则各生物碱斑点的位置偏低，所以Rf值偏小，造成黄连对照药材和供试品的四个斑点只能看到两个，难以分开。具体如图3所示，图中1为盐酸小檗碱对照品；2为黄连对照药材；3～6为供试品。为了避免溶剂蒸气的影响，在做黄连生物碱薄层色谱时，使用的浓氨试液最好是新开瓶的或是开瓶不久的，这样在展开缸中氨蒸气才会达到饱和的状态，对黄连生物碱的分离起到决定性的作用。

图3 黄连解毒散黄连薄层鉴别

2.6 显色剂的影响

薄层板在展开、晾干后，有的可以在日光下直接观察，有的需要在紫外光灯254 nm和365 nm下观察，有的则需要喷显色剂后再进行观察。理想的显色剂应该灵敏度高，可以使斑点颜色稳定，斑点与背景间的对比较明显，而且斑点的大小和颜色的深浅度与所需要检测物质的含量成正比。薄层色谱的显色方式有喷雾显色、浸渍显色和蒸气熏蒸显色等[6]。最常用的是喷雾显色。它是用喷雾瓶把显色剂以气溶胶的形式均匀地喷在薄层板上。如果显色剂是以水滴的形式喷在薄层板上，则很难分辨对照和供试品的斑点是否在相同的位置上显现相同颜色的斑点，影响了结果的准确性。另一个问题是，对于喷完显色剂需要加热的薄层板，需要注意加热的时间和温度。尤其是采用羧甲基纤维素钠为黏合剂制备的薄层板，喷了含有硫酸溶液的显色剂，若加热温度过高或加热时间太长，容易造成薄层板面炭化，就是我们俗称的“糊了”，所以尽量选择在（105±5）℃加热，然后在烘箱旁随时观察，防止薄层板炭化，影响结果的准确性。

2.7 人员操作方面的影响

在对中兽药材和成方制剂进行薄层色谱鉴别的检验时，除了仪器、所用试剂和薄层板的质量外，检验员也是影响因素之一。第一，如果检验员的实验操作流程不符合规范或是使用的检验方法不正确，将导致难以判断检验结果。第二，如果检验员没有丰富的实验操作经验，会出现斑点呈念珠状等薄层色谱检验常见的问题，也会对实验结果的准确性产生影响。为了消除人员操作方面的影响，除了安排具有丰富检验经验的检验员做相关工作外，还应该定期对检验员进行实验操作的培训和考核，及时发现问题并解决。除此之外，还应该要求检验员严格要求自己，按照相关的检验标准和流程进行检验，尽可能地减少人为因素对实验结果的影响，以达到提高检验结果准确性的目的。

3、结束语

除上述影响因素外，薄层板的黏合剂和品牌的不同、试剂和耗材的质量等也会对薄层色谱质量有一定的影响。随着薄层技术的日益发展，操作流程越来越规范，仪器自动化程度不断提高，薄层色谱鉴别将在中兽药材及成方制剂中的分析和检验发挥更大的作用。

参考文献:

[1]孙楠.中药及中成药薄层色谱鉴别检验相关问题的探讨[J].临床医药文献电子杂志,2017,4(27):5290.

[2]国家药典委员会.中国药典分析检测技术指南[M].北京:中国医药科技出版社,2017:160.

[3]刘爱香.中药及中成药薄层色谱鉴别检验中的问题分析[J].光明中医,2018,33(22):3437-3439.

[4]韩立.中药显微鉴别和薄层色谱彩色图集[M].郑州:河南科学技术出版社,2018.

[5]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典(二部)[M].2020版.北京:中国农业出版社,2020:739.

[6]兽用中药检验员:NY/T 2807—2015[S].

文章来源:高红倩,许彬,韩春晓,等.薄层色谱技术在中兽药鉴别中的影响因素分析[J].品牌与标准化,2024,(05):158-160.