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鸭圆环病毒两种基因型PCR鉴定方法的建立及应用

2024-08-15 22 上传者：管理员

摘要：为了建立区分鸭圆环病毒两种基因型的双重PCR方法，试验针对Ducv-1、Ducv-2两种基因型参考序列的Cap基因，设计特异性引物，并对该双重引物进行特异性、敏感性、重复性等试验。结果显示，试验可以特异性地扩增出鸭圆环病毒1型（700 bp）和鸭圆环病毒2型（1 080 bp）毒株的目的条带。该方法仅对鸭圆环病毒1型和2型检测为阳性，对鸭圆环病毒两种基因型的检测限分别为4.20×10～3 copies/uL和4.00×10～3 copies/uL。使用该双重引物进行重复性检测，结果一致，重复性较好。使用建立的该鸭圆环病毒不同基因型鉴定方法对实验室收集的疑似鸭圆环病毒阳性样品进行鉴别诊断，结果显示5份样品在700 bp处出现明亮条带，属于圆环病毒1型，另外1份为阴性。本研究建立的双重PCR方法可用于市场上鸭圆环病毒两种基因型的鉴别诊断，为鸭圆环病毒病的诊断提供参考。

关键词：
Du CV
双重PCR
鉴别诊断
鸭圆环病毒
鸭圆环病毒病
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鸭圆环病毒病是由鸭圆环病毒（Duck circovirus,Du CV）引起的鸭的一种免疫抑制性传染病，感染Du CV后会出现羽毛混乱、生长迟缓、体重减轻等症状[1-3]。

Du CV是一种直径为15～16 nm、无囊膜、二十面体对称，基因组约为1.9 kb的单链环状DNA病毒，属于圆环病毒科，圆环病毒属[4-5]。Du CV最早在2003年由德国的Hattermann等首次报道，后相继在匈牙利、美国、韩国、中国台湾及中国大陆等地发现或报道[6]。依据Du CV的基因组及Cap基因的序列分析[7]，目前将Du CV分为两个基因型：Du CV-1和Du CV-2。目前已经建立了检测Du CV的PCR、荧光定量PCR、核酸探针杂交以及ELISA方法，并完成了流行病学调查。

目前Du CV两种基因型的鉴别方法研究较少，但圆环病毒普遍存在于鸭群中，且普遍存在Du CV-1和Du CV-2混感的情况[8]。本研究建立的圆环病毒1型和2型区分方法中，双重引物共用一条上游引物，降低了引物对反应体系的干扰，且两种基因型仅通过单一目的条带即可有效区分。该方法快速、准确且敏感，对于区分鉴别两种不同基因型圆环病毒提供参考。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 阳性病料

经测序鉴定为阳性的Du CV1型、Du CV2型、鸭经典呼肠孤病毒、新型番鸭小鹅瘟病毒、鸭细小病毒、坦布苏病毒、鹅星状病毒、鸭病毒型肝炎1型、鸭病毒型肝炎3型、鸭瘟病毒病料均为本实验室鉴定、分离和保存。

1.1.2 主要试剂

核酸提取试剂盒，购自杭州博日；Taq DNA聚合酶、d NTP、琼脂糖，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因合成及引物设计

依据Du CV的基因组Cap基因的序列分析，将Du CV分为Du CV-1和Du CV-2。两基因型的核苷酸同源性为82%～84%。根据两种基因型性的参考毒株Du CV-1（登录号AY228555、EF451157、EU022375、GU131340）、Du CV-2（登录号AY394721、DQ166836、DQ166837、EF370476）基因序列，使用Primer Premier 5软件设计引物，首先设计扩增病毒基因全长通用引物，引物序列见表1，再在基因序列内部N端保守区设计一条通用上游引物，在C端碱基差异区设计分别扩增两种基因型的特异性引物，特异性引物序列见表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 PCR引文引物序列

1.2.2 核酸提取

使用杭州博日的核酸自动提取仪进行核酸的提取，分别提取Du CV-1和Du CV-2阳性病料病毒DNA。使用表1中的引物将得到的DNA进行PCR扩增，回收、纯化PCR产物，连接至p MD18-T载体、转化进DH-5α感受态细胞，将菌液均匀涂布于琼脂平板上，37℃培养过夜，挑取阳性克隆提取质粒，PCR扩增后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，鉴定重组质粒是否构建成功。

1.2.3 双重PCR条件的建立

将构建成功的Du CV-1和Du CV-2质粒等体积混合，应用表1中的引物进行双重PCR反应，反应体系按照说明书制备，即：10×PCR Buffer 5 u L,Mg2+(25 m M) 3 u L,d NTP (each10 m M)1 u L,Taq DNA Polymerase(5U/u L)1 u L，模板DNA 1u L，三条特异性引物各2 u L，用dd H2O补齐至50 u L。PCR运行程序为：95℃5 min,95℃30 s,55℃30 s,72℃1 min，至步骤2,30个循环，72℃10 min。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并将阳性产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.4 双重PCR特异性试验

用该双重引物对鸭经典呼肠孤病毒、新型番鸭小鹅瘟病毒、鸭细小病毒、坦布苏病毒、鹅星状病毒、鸭病毒型肝炎1型、鸭病毒型肝炎3型、鸭瘟等阳性病料提取病毒基因组，进行PCR检测，验证该双重引物的特异性。PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳后，Goldenview染色，在紫外线下观察结果。

1.2.5 双重PCR敏感性试验

测定Du CV-1型重组质粒的浓度为4.20×106copies/u L,Du CV-2型重组质粒的浓度为4.00×106copies/u L，分别用dd H2O做10倍稀释，取每个稀释度的模板进行双重PCR做灵敏度测试。

1.2.6 双重PCR方法的初步应用

对本试验获得的6份Du CV疑似阳性病例分别提取病毒DNA，使用双重引物进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，同时将阳性样品送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

2、结果

2.1 两种阳性克隆质粒的制备

提取实验室保存的Du CV-1和Du CV-2阳性病料的DNA，应用Ducv全长通用引物扩增病毒全长基因序列，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到1 993 bp的电泳条带，应用商品化的胶回收试剂盒纯化目的片段，克隆至p MD18-T载体，转化进DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆提取质粒，PCR扩增后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，经PCR鉴定和测定鉴定后，将两种重组质粒分别命名为p Ducv-1和p Ducv-2。质粒鉴定结果见图1。

图1 p Ducv-1和p Ducv-2鉴定电泳图

2.2 双重PCR引物验证

按照生工Taq聚合酶使用说明书，建立50 u L双重反应体系：10×PCR Buffer 5 u L,Mg2+(25 m M)3 u L,d NTP (each 10 m M) 1 u L,Taq DNA Polymerase(5 U/u L)1 u L，模板DNA 1 u L，三条特异性引物各2 u L，用dd H2O补齐至50 u L。PCR反应程序为：95℃5 min,95℃30 s,55℃30 s,72℃1 min，至步骤2,30个循环，72℃10 min。结果如图2所示，Du CV-1型用该双重PCR引物扩增得到700 bp的目的条带，Du CV-2型用该双重PCR引物扩增得到1 080 bp的目的条带。

图2 多重引物电泳图

M.2000bp;1.DuCV-1基因型阳性样本；2.DuCV-2基因型阳性样本；3～4.阴性样品对照。

2.3 双重PCR引物特异性验证

分别提取本实验室保存的Du CV-1、Du CV-2、鸭经典呼肠孤病毒、新型番鸭小鹅瘟病毒、鸭细小病毒、坦布苏病毒、鹅星状病毒、鸭病毒型肝炎1型、鸭病毒型肝炎3型、鸭瘟病毒病料的核酸，制备DNA或c DNA作为模板，dd H2O作为阴性对照进行双重PCR反应，结果显示，只有Du CV-1和Du CV-2型阳性病料扩增出与目的片段大小一致的条带，而其他病毒阳性病料均为扩增出条带，表明建立的双重PCR具有良好的特异性（图3）。

2.4 双重PCR引物敏感性验证

测定Du CV-1型重组质粒的浓度为4.20×106copies/u L,Du CV-2型重组质粒的浓度为4.00×106copies/u L，分别用dd H2O做10倍稀释，取每个稀释度的模板进行双重PCR。结果显示，本次建立的双重PCR可检测到Du CV-1型重组质粒的最小浓度为4.20×103copies/u L,Du CV-2型重组质粒的浓度为4.00×103copies/u L（图4、图5）。

图3 多重引物特异性验证电泳图

M.DL2000 DNA Marker;1.DuCV-1基因型阳性样本；2.DuCV-2基因型阳性样本；3.鸭经典呼肠孤病毒阳性样本；4.新型番鸭小鹅瘟病毒阳性样本；5.鸭细小病毒阳性样本；6.坦布苏病毒阳性样本；7.鹅星状病毒阳性样本；8.鸭病毒型肝炎1型阳性样本；9.鸭病毒型肝炎3型阳性样本；10.鸭瘟阳性样本；11.阴性对照。

图4 多重引物扩增DuCV-1基因型样本敏感性验证电泳图

图5 多重引物扩增DuCV-2基因型样本敏感性验证电泳图

2.5 临床样品的检测

应用建立的双重PCR方法对市场上获得的6份疑似鸭Du CV阳性病料进行鉴定，结果显示，其中5份样本的DNA样品在700 bp处出现明亮条带，均属于圆环病毒1型，1份阴性（图6）。

图6 双重引物扩增临床样品电泳图

3、讨论与结论

Du CV首次在德国发现，2005年在我国境内鸭群中检出。Du CV可破坏鸭的免疫系统，引起鸭的免疫抑制，导致机体免疫力降低，从而引发其他病原菌的继发感染，使二重以及多重感染的概率增加或者加重其他疾病，造成鸭群死亡[9-10]。

近年来，鸭群中Du CV的感染率呈上升趋势，对规模化养殖场的危害越来越严重，因此Du CV成为危害养鸭场的重要病毒之一，目前已经建立了检测Du CV的PCR、荧光定量PCR、核酸探针杂交以及ELISA方法，并完成了流行病学调查[11-13]。

但至今对两种基因型分型快速检测的方法报道较少，本研究根据Du CV两个基因型的Cap基因的保守序列设计了特异性引物，建立了检测两种基因型的双重PCR方法，该双重PCR方法针对每个基因型均能扩增出1条特异性条带，随机抽取的PCR扩增产物及序列分析证实了反应的高度特异性。通过敏感度试验证实该双重PCR方法检测的最低病毒质粒浓度为4.00～4.20×103copies/u L，表明本试验建立的双重PCR方法特异性强、敏感度较高，能够用于两种基因型Du CV的临床分型检测。实际生产中，两种基因型Du CV混合感染的情况可能更为严重，这需要引起生产中的高度关注。

参考文献:

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[4]高攀攀,李玲子,韦良孟,等. 2020年山东省部分地区鸭圆环病毒感染情况分析[J].山东畜牧兽医, 2021, 42(8):1-4.

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