组蛋白甲基化修饰是以染色质结构重塑为主要特征的表观遗传修饰的主要形式之一，其对肿瘤的发生发展具有重要意义[1]。许多高通量测序认为组蛋白甲基化转移酶KMT2C的功能受损与血液系统恶性肿瘤以及实体肿瘤的发生有关[2]。KMT2C基因突变首先在急性髓细胞白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)患者中被发现，也广泛存在于许多实体肿瘤中，如肝癌、膀胱癌等[3-4]。AML是造血系统的髓系原始细胞克隆性恶性增殖性疾病，Kmt2c是AML的肿瘤抑制因子[5],Kmt2c的缺失可能会损害正常的造血系统，促进髓系原始细胞的恶性增殖。

人群测序结果发现，KMT2C基因也是克隆造血的驱动基因[6]。目前已有动物研究表明，Kmt2c的缺失会在体内增强造血干细胞(HSC)的自我更新能力以及骨髓重建能力[7]，但关于Kmt2c缺失的骨髓细胞是否具有体外克隆性扩增能力的研究未见报道。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Kmt2c基因杂合缺失的小鼠模型，旨在探究Kmt2c缺失的骨髓细胞是否具有体外克隆性扩增的能力，进一步明确Kmt2c基因缺失对血液系统的作用。

一、材料与方法

实验动物与分组

Kmt2c基因杂合敲除小鼠由上海南方模式生物科技股份有限公司制备和繁育，动物质量合格证号为SCXK(沪) 2019-0002。SPF级的Kmt2c基因杂合缺失小鼠与C57BL/6J野生型小鼠由中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所屏障环境动物实验室进行饲养，实验动物饲养设施合格证号为SYXK(京) 2019-0050。饲养条件:温度20-22℃，相对湿度60%-70%，动物自由进食饮水，12 h昼夜交替。所有小鼠实验均经中国疾病预防控制中心职业卫生所实验动物管理与福利伦理委员会批准(批准编号:EAWE-2020-07)。

共获得Kmt2c基因杂合缺失小鼠与C57BL/6J小鼠(对照组)各20只，饲养至8周龄后，两组小鼠按体重及血细胞计数各挑选12只，使Kmt2c杂合缺失小鼠与对照组小鼠不存在体重及血常规计数上的差异。每组小鼠随机选择8只用来进行血细胞计数的长期监测，剩余小鼠进行骨髓细胞的分析。

试剂与仪器

目的基因引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，鼠尾直接PCR试剂盒购自美国百迈客公司，KK4601 KAPA SYBR(R) FAST试剂盒和氯仿购自德国默克公司，TRIzol、胎牛血清和IMDM培养基均购自美国赛默飞公司，异丙醇购自国药集团化学试剂有限公司，Promega M6101 RQ1 RNase-Free DNase试剂盒和Promega A3500逆转录试剂盒均购自美国Promega公司，M3434甲基纤维素半固体培养基购自加拿大Stemcell公司，青链霉素混合液购自北京索莱宝科技有限公司，血细胞稀释液购自山东卓越生物技术股份有限公司，流式抗体购自美国BD公司。血细胞分析仪购自上海光电医用电子仪器有限公司，倒置光学显微镜购自奥林巴斯(中国)有限公司，二氧化碳培养箱购自美国赛默飞公司，台式离心机购自德国艾本德公司，恒温水浴锅购自北京科伟永兴仪器有限公司，流式细胞仪购自美国BD公司，PCR仪购自美国伯乐公司。

Kmt2c基因杂合敲除小鼠模型构建

使用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Kmt2c基因杂合缺失的小鼠模型，构建策略见图1。选择7号染色体上的Kmt2c-201转录本的外显子2(exon 2)作为敲除区域，从而使翻译提前终止，导致蛋白突变。在Kmt2c基因exon 2的上下游分别设计两个向导RNA(sgRNA，序列见表1)识别靶位点，sgRNA引导Cas9内切酶对Kmt2c目的等位基因靶位点进行切割，进而在染色单体上产生平末端的DNA双链缺口。断裂的DNA双链通过非同源末端连接修复在DNA双链缺口处产生Kmt2c缺失突变，从而造成Kmt2c的杂合缺失。通过显微注射将sgRNA和Cas9 mRNA注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中。将注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，20 d左右出生的小鼠为F0代的Kmt2c杂合缺失(Kmt2c+/-)小鼠。

基因型鉴定

使用鼠尾直接PCR试剂盒提取尾尖部的DNA，将获取的DNA进行PCR扩增，PCR程序见表2。将获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪获取条带。对照组小鼠的凝胶成像结果显示为单一的2 031 bp片段，Kmt2c杂合小鼠显示为1 155bp和2 031 bp各一条片段。引物序列如下:正向引物5’-GAGAGCTGGGATTAAATGAAGGTT-3’，反向引物5’-ACGCAAGCACGCACGCAATAA-3’。

Table 2.PCR procedure

mRNA水平的检测

提取小鼠骨髓中的总RNA，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录成c DNA。使用KK4601 KAPA SYBR(R) FAST试剂盒进行实时荧光定量PCR检测Kmt2c基因在mRNA上的表达情况。PCR反应条件为95℃预变性3 min后，95℃3 s,60℃20 s,40个循环条件PCR。Kmt2c引物序列如下:正向引物5’-GAGGAAGGAACGCTTACGAGAACAG-3’，反向引物5’-GACAATGCTGCTCCATCTCCATCC-3’，以小鼠Gapdh作为内参基因，引物序列如下:正向引物5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，反向引物5’-TG-TAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’。

体重与血常规监测

小鼠出生6周后每周1次监测两组小鼠的体重和血常规。

骨髓细胞体外集落形成单位(CFU)培养

将8周龄的Kmt2c杂合缺失小鼠和对照组小鼠脱颈处死，抽取两侧股骨、胫骨骨腔内的骨髓。取2×104个骨髓细胞，补充含10%胎牛血清和1%青链霉素混合液的IMDM培养基至100μl，加入900μl的M3434甲基纤维素半固体培养基混匀，转移至35mm培养皿中，每组细胞分别培养3盘。将培养皿置于二氧化碳培养箱培养7-12 d，观察集落生长情况，含有>50个细胞的细胞团计为1个CFU。

造血干/祖细胞比例的检测

由于不同造血干/祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cell,HSPC)表面的抗原性蛋白不同，利用能够结合HSPCs表面蛋白的单克隆抗体可将不同类型的造血细胞分开，抗体组合见表3和4。长期造血干细胞(long-term hematopoietic stem cell,LT-HSC)、短期造血干细胞(short-term hematopoietic stem cell,ST-HSC)和多能祖细胞表面抗体结合情况见表5，使用LSK抗体组合、CD34和CD135抗体可将3群细胞通过流式细胞术分别筛选出来。

骨髓细胞获取方法同上，将两组小鼠的细胞配置成每100μl含1×106个骨髓细胞的悬液，设置空白管(不含细胞)、单阳管、荧光减一对照管和样品管。按照表5设置的流式配色方案进行染色，置于摇床上避光孵育30 min，加入1 ml洗液(含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液)终止染色，1 000 rpm离心5min后弃上清。使用200μl洗液重悬细胞，细胞悬液直接上机检测。

二、结果

Kmt2c杂合缺失小鼠模型构建情况

成功构建4只F0代Kmt2c+/-小鼠，鉴定策略如图2A所示。通过交配繁殖获得20只基因型鉴定为杂合子的F1代Kmt2c+/-小鼠。经基因型鉴定，Kmt2c+/-的小鼠出现1 155 bp和2 031 bp各一条片段(图2A He)，对照组小鼠仅出现一条2 031 bp的条带(图2A wt)。Kmt2c mRNA的表达情况见图2B,Kmt2c+/-小鼠的Kmt2c基因表达量仅为对照组的28%，表明Kmt2c基因已被成功敲低。

Kmt2c+/-小鼠体重及细胞计数的监测情况

Kmt2c+/-小鼠与对照组小鼠的体重及主要血细胞计数变化见图3。如图3A所示，Kmt2c+/-小鼠与对照组小鼠的体重均随着周龄的增长有明显增加的趋势，两组小鼠的体重分别从监测开始时的(17.9±1.0)和(17.3±0.6) g增加到了(24.3±2.3)和(25.2±2.1) g，但未见统计学差异。如图3B所示，两组小鼠的白细胞计数在第12周之前均在6×109/L左右波动，未见明显增加或下降趋势，在第12周之后，Kmt2c+/-小鼠的白细胞开始增加，在监测的第14周时，Kmt2c+/-小鼠的白细胞计数达到(9.8±1.0)×109/L，显著高于对照组小鼠的(7.3±1.4)×109/L(P<0.05)。两组小鼠的红细胞计数均在8.5×1012/L左右波动，无明显上升或下降趋势(图3C)。两组小鼠的血小板计数的变化趋势较为一致，在监测的第5周后均在360×109/L左右波动，Kmt2c+/-小鼠的血小板计数在第0、3、12周低于对照组，其余时期均高于对照组(图3D)。

Kmt2c+/-小鼠骨髓细胞的克隆性扩增

Kmt2c+/-小鼠和对照组小鼠的骨髓细胞体外集落形成实验结果见图4-5。如图4所示，细胞传代前期(第二代和第三代)，Kmt2c+/-小鼠CFU数量均显著低于对照组(均P<0.05);细胞传代第四代，Kmt2c+/-小鼠骨髓细胞的CFU数量显著超过对照组(P<0.05)，并持续到第六代。Kmt2c+/-小鼠和对照组小鼠的CFU形态变化与前述集落形成能力对应。如图5所示，第一代两组小鼠的CFU形态无明显差异，均为较紧密的集落。第二代到第三代，对照组小鼠的CFU紧密程度超过Kmt2c+/-小鼠。第四代到第五代，Kmt2c+/-小鼠CFU的面积和紧密程度逐渐超过对照组小鼠。第六代时对照组未形成集落，而Kmt2c+/-小鼠仍能形成面积较小的集落。综上，CFU数量及形态均提示Kmt2c基因杂合缺失促进了小鼠骨髓细胞的体外克隆形成能力。

HSPC比例分析

使用不同荧光抗体标记小鼠的HSPCs表面抗原，以分析LT-HSC、ST-HSC、多能祖细胞3群造血干/祖细胞的比例变化情况，结果如图6所示，对照组小鼠LT-HSC、ST-HSC的比例分别为16.9%±2.6%、18.9%±2.5%,Kmt2c+/-小鼠分别为19.6%±3.3%、28.9%±4.9%，相比对照组有增高的趋势，但未见统计学差异(P>0.05)，多能祖细胞的比例几乎无变化。LT-HSC和ST-HSC均具有自我更新能力，这一结果提示，Kmt2c基因的缺失可能是通过增加具有自我更新能力的LT-HSC和ST-HSC的比例来提高骨髓细胞的克隆形成能力，对细胞的分化没有明显影响。

三、讨论

随着基因编辑技术的不断发展，CRISPR/Cas9系统被广泛应用于转基因小鼠的构建中。CRISPR/Cas9基因编辑技术来源于细菌和古细菌中的适应性免疫防御功能，是由一条sgRNA识别靶位点，进而产生特定基因类型的工程小鼠，具有设计简单、效率高的特点。本研究利用CRISPR/Cas9系统将Kmt2c基因exon 2区域有效敲除，成功构建了Kmt2c全身杂合敲除的小鼠模型。

7号染色体长臂(q)末端是髓细胞性白血病中经常缺失的染色体区域[8]。动物实验表明，7号染色体的一个拷贝完全缺失(-7q)或部分缺失[del(7q)]均可增加MDS向AML进展的风险，并与化疗耐药的产生有关[8]。KMT2C基因位于7q36.1，已被证明是髓细胞白血病的肿瘤抑制基因[5]。并且，KMT2C是多种肿瘤中突变率较高的基因之一，在乳腺癌、肺腺癌和AML等12种肿瘤中的突变率为0.5%-24.5%[1,9]。KMT2C基因对维持正常造血系统的发育至关重要，人群队列研究表明，突变的KMT2C可作为驱动基因参与克隆造血[6]，克隆造血是血液恶性肿瘤的癌前状态，当克隆造血累积到一定程度就会引起AML的发生。

KMT2C基因缺失最早在MDS和AML的患者中被发现[3-4]。研究表明，Kmt2c基因缺失突变可促进MDS和AML的进展，但单独的Kmt2c基因缺失或抑制不足以驱动白血病的发生[8]。Chen等[5]证明了Kmt2c基因突变需要与7号染色体上的其他基因突变(如P53、Nf1基因突变)联合作用才可以导致白血病的发生。为了探究Kmt2c基因如何调节造血，Chen等[7]在C57的背景下构建了Kmt2c+/-小鼠，通过骨髓的连续竞争性移植发现Kmt2c+/-小鼠HSC在连续移植3个周期后仍具有较强的自我更新能力，而C57小鼠的HSC仅在移植两次后就失去了活性，提示Kmt2c基因的缺失可能是通过增强造血系统的自我更新能力以及骨髓重建能力从而促进肿瘤的发生发展。

本研究结果显示，Kmt2c+/-小鼠在14周时白细胞数开始上升，但增加的白细胞是否最终发生恶性增殖还需要更长时间的监测。本研究体外集落形成实验结果显示，Kmt2c+/-小鼠骨髓细胞具有克隆性扩增的潜能，证实了Kmt2c杂合缺失对细胞克隆扩增的影响，同时说明Kmt2c杂合缺失对骨髓细胞自我更新能力具有促进作用。Kmt2c杂合缺失小鼠体内LT-HSC和ST-HSC比例的增加提示Kmt2c基因的杂合缺失使造血干细胞的自我更新能力增强，HSPC停留在不成熟的阶段，对正常HSPC的分化过程可能有潜在影响，提示Kmt2c基因的缺失可能是通过增强HSPC的自我更新能力促进克隆性扩增和血液恶性肿瘤的发生发展。

Kmt2c基因在不同的肿瘤中其促癌和抑癌的作用各不相同，在胰腺癌、肝癌中表现为促癌作用，而在髓细胞白血病中表现为抑癌作用[5,10-11]，表明基因在肿瘤中发挥作用依赖一定的环境和条件。而Kmt2c缺失如何依赖其他环境促进血液肿瘤的发生发展尚不清楚。本研究通过成功构建Kmt2c+/-小鼠，初步明确了该基因型缺失对小鼠造血系统的影响。该模型的构建以及研究结果有利于进一步探究Kmt2c基因缺失如何联合其他事件促进肿瘤的发生发展。

综上所述，本研究基于CRISPR/Cas9技术构建了Kmt2c基因杂合敲除小鼠模型，发现Kmt2c基因的杂合敲除导致了白细胞计数的增加以及骨髓细胞的克隆性扩增，同时增强了造血干/祖细胞的自我更新能力，这为后续探究Kmt2c基因的功能及其与血液恶性肿瘤的关系提供了数据支持和参考依据。

参考文献:

11袁志青,王贵阳,瞿俊文,等.RNA干扰下调KMT2C基因表达对肝癌细胞HepG2增殖的影响及其机制.肝胆胰外科杂志,2018,30(2):122-126,133.

基金资助:国家自然科学基金项目(82070116);

文章来源:王雪,华东宁,周瑾,等.抑癌基因Kmt2c杂合缺失对小鼠造血系统的影响[J].中国实验血液学杂志,2024,32(05):1571-1577.