通过静脉输注电解质、水、氨基酸、碳水化合物、脂肪、必需的维生素和微量元素，为不能通过肠道摄取营养的患者提供养料，这便是全肠外营养（total parenteral nutrition,TPN)[1]。对于那些无法通过口腔或肠道摄入养分的患者，比如胃肠道疾病、新生儿、重症患者和末期癌症患者，TPN是一种非常重要的治疗方法[2-4]。然而，长时间使用TPN会引发多种并发症，例如肠道屏障受损、感染、黏膜免疫功能异常、肝功能损害和糖代谢异常等[5-6]。人体内的肠道微生物群落是由微小而复杂的微生物组成的，它们在宿主的整个生命周期中扮演着不可或缺的重要角色。它们与宿主分享营养和空间，还参与调节宿主的免疫反应、代谢途径和健康状态[7]。TPN治疗后由于缺乏肠腔内营养，肠道菌群发生显著改变[5,8-10]。更具体地说，通过TPN治疗后，肠道内益生菌如拟杆菌门和变形菌门的数量增加，而对人体健康有益的厚壁菌门的数量减少[11]。然而，目前TPN引起肠道微生物失调的内在机制还不清楚。

肠道中的真菌在调节肠道微生物群落中起到至关重要的作用，它们与其他微生物之间的互动对宿主的健康产生着广泛而深远的影响[12-13]。肠道内的真菌和细菌之间的互动错综复杂，他们不仅通过物理接触或分泌特定分子进行直接交流，还能够通过宿主免疫系统来进行间接的沟通[14]。尽管人们逐渐意识到肠道真菌的重要作用，但有关TPN治疗期间这些微生物如何变化的研究相对稀缺。为了更好地研究这个课题，本研究选择使用TPN模型小鼠和正常对照小鼠作为研究样本，利用对比两组小鼠的肠道真菌菌群结构，探究TPN模型小鼠中肠道真菌群落的改变模式，为研究TPN期间肠道菌群紊乱的机制提供新的见解。

1、材料与方法

1.1 动物模型

C57BL/6健康雄性小鼠，8～10周龄，均购买自江苏集萃药康生物科技股份有限公司（中国成都）。在SPF级环境中，进行实验前需要进行7d的适应性喂养，让实验动物自由进食并保留12h的早晚间断照明。所有实验均严格遵守陆军军医大学动物保护与使用委员会规定的程序（AMUWEC20210174）。通过腹腔注射戊巴比妥钠诱导小鼠麻醉，然后在耳后进行消毒和切口操作。固定小鼠，在右侧颈部进行消毒和切口操作，并进行右侧颈外静脉远心端结扎手术和近心端血管夹夹闭术。在手术中，需要在颈外静脉进行V字切口，将静脉穿刺导管插入0.5cm，并打结固定穿刺导管，然后松开血管夹，使用注射器回抽液体，以确保导管回血通畅。消毒颈部并缝线。手术完成后，将小鼠分为Sham组和TPN组，连接注射泵输液7d。两组小鼠在最初的2d内每小时输注0.167mL生理盐水，以适应静脉输液。后面5dTPN组小鼠输注营养液：第3天输注营养液（0.183mL/h）；第4天输注营养液（0.321mL/h）；第5～7天输注营养液（0.458mL/h);Sham组小鼠在不进食的情况下以相同速度接受生理盐水输注。

1.2 粪便收集和ITSDNA测序

在无菌条件下，对小鼠进行处死后，打开腹腔并分离盲肠。随后使用眼科剪刀将盲肠剪开，将其内容物取出并放入无菌的EP管中，最后于-80℃保存。使用苏州帕诺米克生物医药科技有限公司Illumina平台进行ITSDNA测序。

1.3 ITS序列分析

帕诺米克生物数据挖掘系统和ggplot2(3.4.4)R包被用于完成数据挖掘和图形表示过程。

1.4 统计学分析

利用Chao1指数、Simpson指数、Shannon指数、Pielou＿e指数和Goods＿coverage指数评价Alpha多样性。Beta多样性由基于Bray-Curtis距离算法的主坐标分析（principal co-ordinates analysis,PCoA）和基于Jaccard的非度量多维尺度分析（non-metric multidimensional scaling,NMDS）评估。利用Wilcoxon秩和检验和无配对t检验比较不同群落之间的差异。检验水准α为0.05（双侧检验）。

2、结果

2.1 组间肠道真菌菌群多样性分析

对10个样本进行过滤，去除质量低和长度短的序列，最终得到1741039条优化序列，平均每个样本有174104条序列。TPN组的序列达到了967342条，与之形成对照的Sham组则贡献了773697条。使用qiimedada2denoise-paired方法中的DADA2命令对DNA序列进行去噪处理，最终鉴定出1640种ASVs。运用多个不同指标来综合评估Alpha的多样性。Chao1指数主要用于评估样本中的物种总数；Simpson指数专注于评价物种多样性和均匀度的分布情况；Shannon指数主要用于评估样本不同分类的总数以及它们在整体分类中所占的比例；Pielou＿e指数用来描述样本中群落的均匀程度；Goods＿coverage指数被用来衡量样本中群落的覆盖范围。研究结果显示，Sham组和TPN组在Alpha多样性水平上有明显的不同（P<0.05，图1A）。进行基于Bray-Curtis距离算法的主坐标分析（PCoA）和基于Jaccard的非度量多维尺度分析（NMDS），以评估Sham组和TPN组的Beta多样性。Sham组和TPN组的Beta多样性表现有显著不同。Anosim非参数检验的结果显示，Sham组和TPN组的Beta多样性存在统计学差异（P<0.01）。NMDS的应力值（Stress<0.2）反映了所得结果的可信度和准确性（图1B）。

2.2 组间肠道真菌菌群组成结构分析

两组肠道真菌菌群在门水平上都以Ascomycota（子囊菌门）为主。在纲水平上，两组肠道真菌菌群都以Eurotiomycetes（散囊菌纲）和Sordariomycetes（粪壳菌纲）为主要成员。Sham组和TPN组在属水平上的肠道真菌菌群成分不同，Sham组以Penicillium（青霉菌属）和Aspergillus（曲霉菌属）为主，而TPN组则以Microascus（微囊菌属）、Thermoascus（嗜热子囊菌属）和Mycosphaerella（球腔菌属）为主（图2A）。利用韦恩图进行群落分析，以确定两组之间共有和独有的物种。Sham组的ASV数量为567个，而TPN组的ASV数量为377个。其中，Sham组独立拥有465个ASVs，而TPN组则单独有275个ASVs，另外102个ASVs为两组共同所享有（图2B）。为了更深入地研究韦恩图不同部分的物种分类分布，可以对每个区域的物种丰度进行统计。在门水平上，3个区域的真菌种类主要是属于Ascomycota（子囊菌门）。在属水平上，Sham组特有区域中，主要包括Penicillium（青霉菌属）、Aspergillus（曲霉菌属）、Nigrospora（黑孢菌属）和Mucor（毛霉菌属）。在TPN组特有的区域中，主要包括Malassezia（马拉色菌属）和Trichomerium（多臂菌属）。Penicillium（青霉菌属）、Microascus（微囊菌属）、Mycosphaerella（球腔菌属）和Thermoascus（嗜热子囊菌属）是两组共有区域中主要的真菌物种（图2C）。

图1 TPN模型小鼠与正常对照小鼠肠道真菌群落多样性分析

图2 TPN模型小鼠与正常对照小鼠肠道真菌菌群组成结构分析

2.3 组间肠道真菌菌群标志物种分析

为进一步探究样本之间的物种组成异同，展示不同样本中物种丰度的分布情况，通过热图进行物种组成分析。相对于Sham组，TPN组中Penicillium（青霉菌属）、Aspergillus（曲霉菌属）、Nigrospora（黑孢菌属）、Chlamydomyces（衣藻菌属）、Alternaria（链格孢霉属）和Candida（假丝酵母属）等真菌的相对丰度显著减少（图3A）。为深入研究2组微生物群落之间的相互作用关系，鉴定出主导地位的物种，建立了物种间的关联网络。Ascomycota（子囊菌门）在门水平上具有最强的联通性，各菌群之间密切相关，显现出明显的优势特征。这6个菌属包括Candida（假丝酵母属）、Penicillium（青霉菌属）、Aspergillus（曲霉菌属）、Talaromyces（篮状菌属）、Microascus（微囊菌属）和Sarocladium（帚枝霉属），在属水平上具有较高的联通性（图3B）。比较分析发现，与Sham组相比，TPN组中的Candida（假丝酵母属）和Talaromyces（篮状菌属）的相对丰度明显减少（P<0.01),Penicillium（青霉菌属）的相对丰度也减少（P<0.01),Aspergillus（曲霉菌属）的相对丰度也减少（P<0.01）。另外，与Sham组比较，TPN组内Microascus（微囊菌属）的相对丰度呈上升趋势，Sarocladium（帚枝霉属）的相对丰度则呈下降趋势，但这种变化无统计学差异（图3C）。采用线性判别分析（lineardiscriminantanalysiseffectsize,LEfSe）这一统计方法，可以精确识别出那些能够明显区分2组的关键物种。最终2组一共有39种差异显著物种富集在一起，其中Sham组富集了34种，TPN组富集了5种。与Sham组相比，TPN组在属水平上表现出显著升高的物种主要是Microascus（微囊菌属）和Tomentella（棉革菌属）。与TPN组相比，Sham组在属水平上显著升高的真菌主要包括Penicillium（青霉菌属）、Aspergillus（曲霉菌属）、Talaromyces（篮状菌属）、Nigrospora（黑孢菌属）、Mucor（毛霉菌属）、Alternaria（链格孢霉属）、Saccharomyces（酿酒酵母属）、Trichoderma（木霉属）、Fusarium（镰刀菌属）和Humicola（腐质霉属）（图3D）。

2.4 组间肠道真菌菌群功能分析

进行基于MetaCyc的PICRUST2功能预测，以研究两组菌群的功能差异。在Sham和TPN两组的所有样本中，辅酶、修复基因、电子传导体和维生素生物合成，脂肪生物合成及呼吸这3个通路的活性最高（图4A）。PCoA分析结果表明，在MetaCyc功能分类方面，两组之间存在明显的差异（P<0.05，图4B）。经过对MetaCyc通路活性相对丰度进行对比分析发现，与Sham组相比，TPN组中有9条通路的活性升高，有3条通路的活性下降（图4C、D）。

图3 TPN模型小鼠与正常对照小鼠肠道真菌菌群标志物种分析

3、讨论

本研究利用高通量ITS测序技术对TPN模型小鼠和正常对照小鼠进行肠道真菌群落分析。研究结果显示，与正常对照小鼠相比，TPN模型小鼠的肠道真菌群Alpha多样性发生明显变化，差异具有统计学意义（P<0.05）。另外，Beta多样性指标的结果表明，TPN模型对小鼠肠道真菌多样性和组成结构产生了显著影响，这种影响具有统计学差异（P<0.01）。利用物种关联网络分析，本研究发现Candida（假丝酵母属）、Penicillium（青霉菌属）、Aspergillus（曲霉菌属）、Talaromyces（篮状菌属）、Microascus（微囊菌属）和Sarocladium（帚枝霉属）等之间具有较强的连通性的优势物种。通过LEfSe分析，本研究发现Candida（假丝酵母属）、Talaromyces（篮状菌属）、Penicillium（青霉菌属）和Aspergillus（曲霉菌属）等具有显著差异的关键生物标记物。与Sham组相比，TPN组Candida（假丝酵母属）和Talaromyces（篮状菌属）的相对丰度出现明显下降（P<0.01),Penicillium（青霉菌属）的相对丰度也有明显下降（P<0.01），同时Aspergillus（曲霉菌属）的相对丰度也呈现明显下降趋势（P<0.01）。

TPN自20世纪中叶被引入临床应用以来，对那些无法通过肠道摄取营养的患者来说，一直扮演着重要的营养输送角色[15-16]。TPN是一种为无法通过肠道摄取营养的患者提供充分的均衡能量、大量重要营养素和微量营养素的营养供给方式，其营养物质包含电解质、水、碳水化合物、氨基酸、脂肪、维生素和微量元素，以维持体质量，预防和纠正营养不良[17]。然而，接受过长时间TPN治疗的患者可能会发生严重的并发症。有研究指出，TPN模型动物的肠道出现了显著的萎缩，肠道屏障遭到破坏，以及黏膜免疫功能出现异常的现象[18-19]。此外，长期TPN治疗还有可能引发胆汁淤积性肝损伤，表现为肝脏炎症、脂肪变性、血脂异常、葡萄糖不耐受和肝纤维化等症状[20-21]。

图4 TPN模型小鼠和正常对照小鼠肠道真菌菌群的功能分析

在肠道内，真菌是一种生活在其中的微生物，它与机体的免疫系统和肠道细菌相互作用，维持着平衡，对保持身体健康起着重要作用[22]。之前的研究发现，在消化系统疾病中，如炎症性肠病[23]、结直肠癌[24]和肝硬化[25]，肠道内的真菌菌群存在失调现象。然而，关于长期TPN治疗后肠道真菌的变化，目前尚未有相关研究数据。本研究观察到TPN模型对肠道小鼠的真菌菌群多样性和组成结构产生了明显影响，这进一步验证了TPN后肠道真菌菌群失调导致肠道菌群紊乱的假设。有研究报道，肠道真菌通过Dectin-1修饰肠道菌群，从而调节肠道免疫。Dectin-1是一种C型凝集素受体，在树突状细胞和巨噬细胞中表达。Dectin-1可被真菌主要细胞壁成分β-葡聚糖激活，诱导靶向革兰阳性菌的抗菌肽产生。Dectin-1敲除小鼠结肠中，靶向革兰阳性菌的抗菌肽减少，导致共生细菌鼠乳杆菌增加，诱导调节性T细胞扩增，从而缓解DSS诱导的结肠炎[26]。肠道真菌菌群失调导致肠道细菌菌群紊乱，加重肠道疾病。右旋糖酐-硫酸钠（dextran sulfate sodium,DSS）诱导的结肠炎小鼠肠道中，Candida（假丝酵母属）和Penicillium（青霉菌属）显著增加。服用抗真菌药物后，小鼠肠道细菌Bacteroides（拟杆菌属）和Lactobacillus（乳酸杆菌属）显著增加，产生丁酸的Clostridium（梭菌属）和Anaerostipes（粪厌氧棒杆菌属）显著减少，导致更严重的急性DSS结肠炎[27]。补充共生真菌能够治疗胃肠道疾病。补充酵母菌能够增加肠道免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA）水平，增强宿主肠道免疫和改善肠道屏障完整性，从而抵御病原微生物的侵袭[28-29]。本研究观察到在TPN组中，Candida（假丝酵母属）、Talaromyces（篮状菌属）、Penicillium（青霉菌属）和Aspergillus（曲霉菌属）等真菌的相对丰度明显减少。可以选择TPN后减少明显的真菌作为潜在的治疗菌株，为治疗TPN有关的肠道并发症提供新的方向。

总之，本研究发现与正常小鼠相比，TPN模型小鼠的肠道真菌菌群组成结构发生明显改变，肠道真菌菌群明显失调。恢复肠道真菌菌群稳态可能成为预防TPN引起的并发症的一种新思路。然而，本研究仅是一项观察性研究，目前的数据还不足以进一步探讨其中的因果关系，故存在明显的限制。需要对TPN模型小鼠肠道内真菌多样性和组成变化的潜在机制，以及真菌对TPN模型小鼠肠道菌群紊乱的具体作用机制进行更深入的研究。

基金资助:国家自然科学基金面上项目(82270585); 军事医学高新技术培育项目(CX2019JS212)~~;

文章来源:谢会超,陈弈辉,刘星宇,等.全肠外营养模型小鼠肠道真菌多样性及构成改变[J].陆军军医大学学报,2024,46(21):2407-2414.