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建立LC-MS/MS法测定大鼠尿液和粪便中WSJ-537的浓度及其在大鼠体内的排泄行为

2020-06-22 928 上传者：管理员

摘要：目的建立LC-MS/MS法测定大鼠尿液和粪便中WSJ-537的浓度,并研究其在大鼠体内的排泄行为。方法使用乙腈沉淀法进行排泄物样品预处理,选用乙氧苯柳胺作为内标进行检测。色谱柱:AcquityTMUPLCBEHC18柱(2.1mm×50mm,1.7μm);流动相:水(含0.1%甲酸)-乙腈(含0.1%甲酸),梯度洗脱;流速:0.3mL•min-1。LC-MS/MS法测定大鼠尿液和粪便中WSJ-537的浓度。结果WSJ-537在4～4000ng•mL-1与峰面积线性关系良好,所建立方法的准确度、精密度、提取回收率、基质效应和稳定性均符合要求。WSJ-537单剂量灌胃给药5.2mg•kg-1后,大鼠尿液中的累积排泄总量为(235.09±316.88)ng,大鼠粪便中的累积排泄总量为(3742.74±2267.77)ng,排出体外的原形药物总量约占总给药量的0.36%。结论该方法预处理步骤简便,分析时间短,线性范围宽,灵敏度高,可用于研究WSJ-537在大鼠体内的排泄行为。

关键词：
LC-MS/MS
WSJ-537
实验医学
排泄
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随着人们生活水平的提高，高尿酸血症的患病率在全世界范围内呈逐年上升的趋势[1]，中国内地高尿酸血症患病率约为13.3%[2]；根据美国国家健康与营养调查的数据显示，美国成年人高尿酸血症患病率约为20%[3]。高尿酸血症已经成为继高血糖、高血压、高血脂之后的“第四高”[4]。高尿酸血症不仅是痛风的直接诱因，还与心血管疾病[5,6,7,8,9]、代谢综合征[10,11,12,13]、肾脏疾病[14,15,16]等的发生发展密切相关。

目前，高尿酸血症的治疗药物主要有三类：抑制尿酸生成药、促进尿酸排泄药和促进尿酸代谢药。抑制尿酸生成药主要是黄嘌呤氧化酶抑制剂。别嘌醇在临床上常作为降尿酸的首选药物，有高效低价的优势，但也有多种不良反应[17,18,19]。非布司他疗效优于别嘌醇[20,21]，但心血管不良反应事件相对较多[22,23]。促进尿酸排泄的药物主要有丙磺舒和苯溴马隆以及新上市的雷西那德[24,25,26]。此类药物常与黄嘌呤氧化酶抑制剂类药物联用，其降尿酸效果较单独使用更好。促进尿酸代谢的药物主要有拉布立酶[27]和培格洛替酶[28]，但此类药物不良反应严重，应用受限。

因此，研发新型的、不良反应较轻的黄嘌呤氧化酶抑制剂类药物对于降尿酸的治疗十分必要。WSJ-537，即2-(3-基-4-正丙氧基）苯基-4-(2-噻吩）噻唑-5-甲酸[2-(3-cyano-4-n-propoxy)phenyl-4-(4-nitro)benzothiazole-5-formicacid]是以非布司他为模板合成的黄嘌呤氧化酶抑制剂类化合物。前期体外药理研究发现，其黄嘌呤氧化酶抑制活性（IC50=0.005µmol·L-1）高于非布司他（IC50=0.01µmol·L-1)[29]。此前有文献建立了测定大鼠血浆中WSJ-537的方法[30]，本实验首次建立了LC-MS/MS法测定大鼠尿液和粪便中WSJ-537的浓度，可用于研究其在大鼠体内的排泄行为。

1、材料

1.1试药

WSJ-537（纯度≥98.0%，编号：2019-0812，沈阳药科大学药物化学教研室自制）；乙氧苯柳胺（纯度：99.8%，编号：100680-200901，中国食品药品检定研究院）；甲醇和甲酸（色谱纯，迪马科技有限公司）；乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）。

1.2仪器

Acquity TMUPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；ABQtrap5500三重四级杆串联质谱仪（美国ABSciex公司）；D3024R高速离心机（北京大龙兴创仪器有限公司）；XW-80A旋涡混匀器（上海青浦沪西仪器厂）；AE200电子分析天平（MEttler Toledo仪器上海有限公司）；JF-200高速组织匀浆机（上海标本模型厂）。

1.3动物

SPF级Sprague-Dawley大鼠8只，雄雌各半，体重（200±20)g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK（辽）2015-0001。实验前，将大鼠放置于实验室使其充分适应。给药前禁食12h，可自由饮水。

2、方法与结果

2.1测定条件、溶液配制及样品处理

2.1.1色谱条件

色谱柱：AcquityTMUPLCBEHC18柱（2.1mm×50mm,1.7μm）；流速：0.3mL·min-1；柱温：45℃；进样量：7µL；流动相：A为水（含0.1%甲酸），B为乙腈（含0.1%甲酸）；梯度洗脱程序：0～0.5min,80%A;0.5～0.8min,80%～20%A;0.8～2.5min,20%A;2.5～3.5min,20%～80%A。

2.1.2质谱条件

采用电喷雾（ESI）离子源，多反应监测模式（MRM）进行正离子检测；定量分析的离子反应分别为：WSJ-537m/z409.8→367.8，乙氧苯柳胺（内标，IS)m/z258.1→121.0。最佳碰撞能量为WSJ-537:28eV;IS:37eV。离子源温度为550℃，电压为4500V。WSJ-537及内标的二级全扫描质谱图如图1所示。

图1WSJ-537(A）及内标（B）的二级全扫描质谱图

2.1.3工作溶液和质控溶液的配制

精密称取WSJ-537及乙氧苯柳胺对照品约10mg，置于10mL量瓶中，加入甲醇溶解定容至刻度线，制成1mg·mL-1的WSJ-537及乙氧苯柳胺储备液。精密量取WSJ-537储备液，并用甲醇逐级稀释制得质量浓度为4、10、50、200、500、2000、4000ng·mL-1的系列对照品溶液，以及质量浓度分别为10、400、3200ng·mL-1的质量控制（QC）溶液。精密量取乙氧苯柳胺储备液，用甲醇稀释，制成200ng·mL-1的内标工作溶液。

2.1.4排泄样品的制备

将粪便样品充分研磨，称取0.10g放置于10mL离心管中，加入1mL甲醇。用匀浆机进行样品的匀浆处理，匀浆后超声5min，离心6min，取上清液作为待测粪便匀浆液。

取25µL内标工作溶液加入到1.5mL离心管中，加入50µL尿液样品或待测粪便匀浆液，涡旋15s，加入175µL乙腈，涡旋30s，以10800r·min-1离心8min，取10µL上清液置于新的1.5mL离心管中，并加入90µL乙腈，涡旋15s后，移入进样瓶中待测。

2.2方法学验证

2.2.1专属性

取空白尿液及粪便匀浆液样品、分别加入WSJ-537和内标的尿液或粪便匀浆液样品、实际尿液及粪便匀浆液样品，按照“2.1.4”项下方法处理，进样测定，色谱图见图2和图3,WSJ-537和内标的保留时间分别为1.70min和1.60min。结果表明，尿液和粪便中的内源性物质不干扰WSJ-537及内标的测定。

图2大鼠尿液中WSJ-537和内标的色谱图

图3大鼠粪便中WSJ-537和内标的色谱图

2.2.2标准曲线与定量限

配制浓度相当于4、10、50、200、500、2000、4000ng·mL-1的尿液或粪便匀浆液样品。按“2.1.4”项下方法操作，每个浓度进行双样本分析，以WSJ-537与内标峰面积的比值为纵坐标，WSJ-537浓度为横坐标，用加权最小二乘法进行线性回归运算，求得大鼠尿液中WSJ-537的标准曲线为Y=1.40×10-3X+6.27×10-3,r=0.9974；粪便中WSJ-537的标准曲线为Y=3.98×10-3X+6.57×10-3,r=0.9941。WSJ-537的线性范围均为4～4000ng·mL-1，定量限为4ng·mL-1。

2.2.3准确度与精密度

配制含4、10、400和3200ng·mL-1（定量限、低、中、高浓度）WSJ-537的尿液或粪便匀浆液样品各6份，按“2.1.4”项下方法操作，连续分析3d，计算WSJ-537的准确度和批间、批内精密度，结果符合生物样品检测要求[31]，见表1。

表1LC-MS/MS法测定大鼠尿液与粪便中WSJ-537的精密度与准确度

2.2.4提取回收率

配制含10、400和3200ng·mL-1（低、中、高浓度）WSJ-537的尿液或粪便匀浆液样品各6份，按“2.1.4”项下方法操作，得色谱峰面积A；先将大鼠空白排泄样品用乙腈沉淀后，再加入3个浓度的质控溶液与内标工作溶液，每一浓度进行6样本分析，得色谱峰面积B。用A与B均值的比值计算WSJ-537与所用内标在大鼠尿液或粪便中的提取回收率，结果见表2。

2.2.5基质效应

以水代替大鼠空白排泄样品，配制含10、400和3200ng·mL-1（低、中、高浓度）WSJ-537的样品各6份，按“2.1.4”项下方法操作，得色谱峰面积C。以B与C均值的比值计算WSJ-537与所用内标在大鼠尿液或粪便中的基质效应，结果见表2。

表2LC-MS/MS法测定大鼠尿液与粪便中WSJ-537与内标的提取回收率与基质效应

2.2.6稳定性

考察大鼠排泄样品在室温下放置6h、3次冻融循环、样品处理后在自动进样器内放置48h、-80℃冰箱放置30d的稳定性。结果见表3，样品稳定性符合生物样品测定要求。

表3LC-MS/MS法测定大鼠尿液与粪便中WSJ-537的稳定性

2.3排泄研究

2.3.1样品的采集

将8只SD大鼠称重并标号，灌胃给药WSJ-537，浓度为5.2mg·kg-1。在给药后0～3h、3～6h、6～9h、9～12h、12～24h、24～36h、36～48h、48～60h、60～72h收集大鼠尿液和粪便。记录尿液的体积和粪便晾干后的重量。

2.3.2结果

大鼠口服灌胃给药5.2mg·kg-1WSJ-537后，尿液中平均药物累积排泄量-时间曲线见图4，粪便中平均药物累积排泄量-时间曲线见图5。口服给药后的0～6h内，WSJ-537在尿液中的累积排泄量较大，6～24h内缓慢增加，24h后排泄量极少。口服给药后的0～24h内，WSJ-537在粪便中的累积排泄量较大，24h后排泄量较少。大鼠尿液中的累积排泄总量为（235.09±316.88)ng,0～72h尿液中平均累积排泄率为（0.023±0.030）%；大鼠粪便中的累积排泄总量为（3742.74±2267.77)ng。排出体外的原形药物总量约占总给药量的0.36%，占比极少，药物进入体内后可能被转化成其他形式的代谢产物排出体外。

图4大鼠口服灌胃给药5.2mg·kg-1WSJ-537后尿液中药物累积排泄量-时间曲线

图5大鼠口服灌胃给药5.2mg·kg-1WSJ-537后粪便中药物累积排泄量-时间曲线

3、讨论

本实验首次建立了LC-MS/MS法测定大鼠尿液和粪便中WSJ-537的浓度，分析时间为3.5min，分析时间短，有利于大量生物样品的测定；采用梯度洗脱的方式更好地实现了色谱峰分离；流动相中加入甲酸提高了方法的灵敏度并改善了峰形；使用乙腈作为沉淀剂，样品前处理方法简单快捷。采用正离子监测模式，WSJ-537响应较好。

本方法成功地用于研究WSJ-537在大鼠体内的排泄行为，结果表明排出体外的原形药物总量占比极少，说明药物进入体内后可能被转化成其他形式的代谢产物排出体外，其生物体内代谢行为有待进一步探究。

参考文献：

[29]王绍杰,施翔,林园园.2-(3-氰基-4-烷氧基)苯基-4-取代噻唑-5-甲酸类化合物､组合物及其制备方法和用途:CN103333134B[P].2013-10-02.

时月,林成江,阎成炟,孙珊珊,林建阳.LC-MS/MS法测定大鼠尿液和粪便中WSJ-537的浓度及其在大鼠体内的排泄研究[J].中南药学,2020,18(06):924-929.

基金:国家自然基金青年科学基金项目(No.81302841);辽宁省高等学校优秀人才支持计划(No.LJQ2014086).