铁是中枢神经系统生长发育必不可少的微量元素，影响脑的多种功能，包括神经递质的生物合成，髓鞘和蛋白质合成以及代谢功能等，在神经系统的发育中起重要作用[1,2]。研究表明脑铁缺乏会导致婴儿神经发育障碍和认知能力的降低[3]。脑铁过载又可能会通过芬顿反应产生自由基，引起氧化应激和产生自由基，继而引发神经退行性疾病，比如阿尔茨海默症、帕金森病等[4]。

铜蓝蛋白(ceruloplasmin, CP)是一种主要由肝脏合成的多铜氧化酶。它有两种形式：分泌形式(血清铜蓝蛋白)和糖基磷脂酰肌醇锚定形式(glycosylphosphatidylinositol ceruloplasmin, GPI-CP)。正常情况下，血液中的CP是不能通过血-脑屏障进入脑组织内的，脑内有自身合成CP的能力。脑毛细血管床周边的星形胶质细胞可以合成CP,主要以GPI锚定形式存在。在中枢神经系统中，神经元和其他细胞仅仅发送需铁的信号给内皮细胞，然后内皮细胞就会把储存的铁释放到细胞外，进而被星形胶质细胞吸收和传递，然后把铁分配给脑中其他类型的细胞。铁从星形胶质细胞运送到脑细胞的过程，需要借助膜铁转运蛋白1(ferroportin1,FPN1)和CP 的共同作用。有研究显示，CP有亚铁氧化酶活性，能调节铁的平衡，对于铁进出脑细胞，起着很重要的作用[5,6]。但是CP在脑铁代谢中的确切功能还不明确。本实验通过建立星形胶质细胞特异性敲除CP(CPGFAPcKO)小鼠模型，研究年轻小鼠星形胶质细胞特异性敲除CP对脑铁代谢的影响。。

一、材料和方法

1. 材料

6月龄雄性C57BL/6 小鼠88只，购自北京维通达生物技术有限公司[动物使用许可证号：SYXK(冀)2022-002]。所有小鼠均选用国家标准啮齿类动物饲料饲养，正常光照环境温度为(21±2)℃,人工照明时间：8∶00～20∶00,相对湿度为45%～55%,自由饮水和摄食。

小鼠抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)单克隆抗体购于美国Millipore公司(1∶500)(货号：MAB360),羊抗小鼠CP一抗购自美国Sigma-Aldrich公司(1∶500)(货号：C0911)。血清铁和肝铁试剂盒购自于南京建成生物工程研究所(货号：A039-1-1,A039-2-1)。激光共焦显微镜购于德国 ZEISS LSM公司，化学发光成像分析仪购自日本 FUJIFILM公司。

2. 方法

2.1 CPGFAPcKO转基因小鼠的制备：

实验选用6月龄小鼠，以C57BL/6为遗传背景，CPflox/flox小鼠由北京维通达生物技术有限公司制备。我们选取CPflox/flox小鼠与GFAP-cre转基因小鼠进行杂交，得到杂合子代小鼠，即CPflox/w,并带有GFAP-cre重组酶的小鼠；将杂合子代小鼠进行配种，产生子代并通过基因型鉴定，选取CPflox/flox小鼠和带有GFAP-cre重组酶的CPflox/flox小鼠，即CPGFAPcKO。

2.2 实验分组：

动物被分为两组，对照组和实验组。对照组：WT小鼠，CPflox/flox小鼠，GFAP-cre转基因小鼠；实验组：CPGFAPcKO转基因小鼠。

2.3 基因组DNA的提取和基因型鉴定：

小鼠尾尖DNA的提取： 剪鼠尾约0.5 cm, 加入500 μl裂解液，将鼠尾剪碎，加入蛋白酶K,55 ℃水浴，消化过夜。加入500 μl酚-氯仿混合液，室温静置30 min。离心12 000×g,5 min。吸取上清，加入等体积异丙醇，离心15 min。倒去异丙醇，留下沉淀。加入75%乙醇，混匀。离心5 min, 倒净乙醇，风干，用灭菌水溶解，水浴1 h, 测定浓度。PCR产物扩增，GFAP-cre 引物序列oIMR1084: 5’-G C G G T C T G G C A G T A A A A A C T A T C-3’, Cre-R: 5’-C C T T C C A G G G C G C G A G T T G A T A G CT-3’,CPflox/flox引物序列CP-seq-F: 5’-C A A A A A A G C C A C T C A A C A G C A C C-3’, CP-seq-R: 5’-C A G C T T G C A G T C C A T T T A G T C -3’,PCR扩增。用琼脂糖凝胶电泳检测GFAP-cre 、CPflox/flox的PCR产物，120V恒压电压，用EB染色，最后用Fujifilm Las-4000观察，扫描图像。

2.4 免疫荧光组织化学染色：

取对照组CPflox/flox小鼠和实验组CPGFAPcKO转基因小鼠各3只，用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，经生理盐水灌流，后用含4%多聚甲醛的PB灌流固定，将脑取出，放入含4%多聚甲醛的PB,4 ℃后固定6 h。再依次放入10%、20%、30%蔗糖溶液脱水，然后包埋连续冷冻切片，厚15 μm。3%双氧水去除过氧化氢酶，枸橼酸钠溶液微波修复，5%BSA室温封闭1 h, 加入小鼠抗GFAP一抗(1∶500),羊抗小鼠CP一抗(1∶500),免疫双标染色时，把相应的两种抗体按1∶1混合，用PBS作为阴性对照，4 ℃过夜。Dylight 488 标记的羊抗小鼠二抗，Alexa Fluor 549标记的兔抗羊二抗，37 ℃孵育50 min。DAPI染色4 min, 抗荧光淬灭剂封片，用激光共焦显微镜观察并采集图像。

2.5 Western boltting 检测皮层和海马区CP蛋白水平：

对照组CPflox/flox小鼠和实验组CPGFAPcKO转基因小鼠，用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，经生理盐水灌流，快速断头取脑，分离皮层和海马，加入组织裂解液RAPI,超声破碎组织，然后4 ℃离心，12 000×g,20 min。吸取上清，用BCA蛋白分析试剂盒微孔酶标仪测定蛋白浓度，变性处理，制成蛋白质样品，经过上样、电泳、转膜后，加入5%脱脂奶粉，室温摇床封闭1.5 h。加入羊抗小鼠CP(1∶5000)一抗，4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗涤后，加入兔抗羊二抗(1∶5000),室温孵育90 min。用化学发光分析系统 Fujifilm LAS-4000 观察，扫描图像。

2.6 Morris水迷宫实验方法[7] 进行小鼠行为学检测：

小鼠放在1个圆桶中，分为4个象限，在每个象限的壁上都有不同的标志。站台放在4个象限中的任何一个均可，水温恒定在(22±2)℃。实验第1天和第2天让小鼠适应游泳，站台暴露。从第3天开始正式进入实验，水面高于站台0.5～1 cm, 将小鼠面向池壁分别从4个象限依次放入水中，每个象限给小鼠120 s时间寻找平台，电脑记录其寻找到站台的时间(潜伏期)和路程以及运动轨迹，连续记录5 d, 直到第7天。第8天撤去平台，记录小鼠在120 s内小鼠穿过平台的次数，在目标象限停留的时间，并进行统计学分析。

2.7 星形胶质细胞敲除铜蓝蛋白，对皮层区和海马区铁水平的影响

2.7.1 同步辐射微束X线荧光光谱法(μ-probe X-ray fluorescence, μ-XRF)测铁元素在脑内的分布：

小鼠用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉后，用生理盐水灌流，然后用4%多聚甲醛灌流固定，将脑取出，放入4%多聚甲醛中后固定6 h。固定好的脑放入30%蔗糖溶液中，待沉底后，冷冻后进行切片，厚50 μm, 贴于3 mm厚的麦拉膜上。脑切片变干后放入真空干燥器内。

采用同步辐射μ-XRF对脑切片进行铁元素分布测定，测定在北京同步辐射中心 (Beijing synchrotron radiation facilit, BSRF) 4 W1B线站，X线荧光光谱仪上进行。电流150～250 mA,储存环中的电子能量为2.2 GeV。X线光斑的大小为50 μm×50 μm。入射X线的能量是由W/B4C高光子通量的双多层膜单频器在15 keV单色化，并通过多毛细管透镜聚焦到50 μm的直径，在每个点停留的实时为25 s, 步幅 200 μm。皮层的扫描面积是2000 μm×800 μm, 海马的扫描面积是2600 μm×1400 μm。通过PyMca 5.9软件进行数据转换，并用Origin 8.0制图。

2.7.2 电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma-mass spectrometry, ICP-MS),检测CPGFAPcKO小鼠皮层、海马区铁含量：

把组织倒入加有浓HNO3的消解管中，同时取两只空白管只加浓硝酸做对照。在消解仪上进行消解，直到消解完全。消解完毕的样品使用不含金属的超纯水定容，待检测。按照ICP-MS测定铁的工作条件，制备铁含量的标准曲线，范围是(0～2)×10-7,将样品溶液和空白溶液分别导入仪器中测定，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，仪器自动测定，绘制工作曲线，计算分析结果。

2.8 血清铁和肝铁的测定：

小鼠用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，摘取眼球取血，后用生理盐水灌流，待肝脏变白，摘取小鼠的肝脏，称其重量，按重量(g):体积(ml)=1∶9的比例，冰水浴条件下超声波匀浆，离心2500 r/min, 10 min, 取上清液准备测定。眼球取出的血，室温静置30 min, 离心3000 r/min, 10 min, 取上清液待测。随后的操作按照组织铁和血清铁试剂盒说明书进行。

3. 统计学处理

应用Graphpad Prism v5.0软件进行统计学分析，计量资料以均值±标准差

表示，小鼠行为学、ICP-MS方法检测铁含量以及血清铁和肝铁的测定，这些数据均采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),实验组与不同对照组的比较采用Newman-Keuls检验进行分析；检测小鼠皮层和海马区CP的表达，采用双尾Student’s t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1. 星形胶质细胞通过Cre/loxP系统特异性敲除CP

1.1 小鼠基因型鉴定：

为了得到CPGFAPcKO小鼠，我们将CPflox/flox小鼠与携带有GFAP-cre重组酶的转基因小鼠进行杂交。子代小鼠在3周龄之前剪取尾尖，提取DNA,用相应引物进行 PCR扩增，鉴定小鼠基因型。Floxp的鉴定结果：仅含有589bp条带的是WT小鼠；仅含有678bp条带的是带有Floxp的纯合小鼠CPflox/flox(图1A)。GFAP-cre的鉴定结果：不含有550bp条带的是WT小鼠；含有550bp条带的是带有GFAP-cre的小鼠(图1B)。

本实验采用6月龄雄性小鼠，仅含678 bp条带，且不含550 bp条带，即CPflox/flox小鼠；含678 bp条带，且含550 bp条带的小鼠，即CPGFAPcKO小鼠为敲除组。

1.2 免疫荧光染色：

采用免疫双标方法，观察小鼠皮层和海马区星形胶质细胞中CP的表达。结果显示，CPflox/flox小鼠GFAP和CP有共定位，而CPGFAPcKO小鼠GFAP和CP很少有共定位，说明星形胶质细胞敲除了CP(图2)。

图1 野生型、CPflox/flox、GFAP-cre和星形胶质细胞敲除CP小鼠基因型PCR鉴定结果

图2 免疫荧光双标检测CPflox/flox和CPGFAPcKO 小鼠脑内皮层(A)、海马(B)GFAP(绿色，星形胶质细胞的特异标记)和CP(红色)的表达； DAPI标记细胞核 标尺示25 μm

1.3 Western blotting检测CP蛋白的表达：

用Western blotting方法检测小鼠皮层和海马区CP的表达，结果显示，CPGFAPcKO 小鼠的CP蛋白的表达量比对照组减少大于60%(图3)。

图3 星形胶质细胞敲除CP基因后，皮层和海马区CP蛋白的表达量

图4 Morris水迷宫实验检测，星形胶质细胞敲除CP基因损伤了小鼠的记忆力

在训练期，小鼠找到平台的耗时（A）；撤台后，在目标象限停留时间的百分比（B）；撤台后，小鼠穿过平台次数的平均值（C),*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；各组数据为,n=6

图5 μ-XRF测定星形胶质细胞敲除CP基因后，小鼠皮层区(A)和海马区(B)铁分布和含量

2. CPGFAPcKO小鼠学习记忆能力下降

选取6月龄WT,GFAP-cre, CPflox/flox和CPGFAPcKO小鼠各6只，统计小鼠找到平台的潜伏期时长，在目标象限停留时间的百分比以及穿过平台的次数。结果显示，CPGFAPcKO小鼠找到平台的时间比其他3组小鼠长(图4A),并且在撤去平台后，目标象限停留的时间百分比短(图4B),穿过平台的次数少(图4C)。以上结果证明，星形胶质细胞敲除CP基因会加重小鼠认知能力和记忆力受损。

3. CPGFAPcKO小鼠皮层和海马区铁水平表达降低

3.1 同步辐射方法检测CPGFAPcKO小鼠皮层、海马区铁水平：

选取CPflox/flox和CPGFAPcKO小鼠同一位置的脑片，在北京4 W1B站，同步辐射检测小鼠皮层(图5A)和海马(图5B)的铁含量。红色代表铁含量高，蓝色代表铁含量低。CPGFAPcKO组无论是皮层还是海马区铁含量都比CPflox/flox组明显降低。

3.2 ICP-MS法检测CPGFAPcKO小鼠皮层、海马区铁含量：

应用ICP-MS技术检测皮层区和海马区的铁水平。结果显示，敲除组无论是皮层区(图6A)还是海马区(图6B)铁含量均降低。

图6 ICP-MS检测星形胶质细胞敲除CP基因后小鼠皮层区和海马区铁含量

皮层区总铁含量（A）；海马区总铁含量（B),*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；各组数据为,n=3

Total iron contents in the cortex (A);Total iron contents in the hippocampus(B),*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;Data were presented as the,n=3

4. CPGFAPcKO小鼠的外周铁水平无明显变化

用血清铁和组织铁试剂盒检测了血清铁和肝铁含量。结果显示，无论是血清铁(图7A)还是肝脏铁(图7B)都没有变化。说明星形胶质细胞敲除CP基因对外周铁代谢并没有影响。

图7 星形胶质细胞敲除CP基因后，血清铁和肝铁的变化

Fig.7 Iron contents in liver and serum in CPGFAPcKO and three control groups

血清铁含量（A）；肝铁含量（B）；各组数据为,n=5(A),n=4(B)

Serum iron level (A);Liver iron level(B);Iron levels were presented as the,n,n=5(A),n=4(B)

三、讨论

铁是维持脑发育不可缺少的微量元素，脑内铁稳态的维持，需要许多铁摄入和释放的分子，比如CP。GPI-CP是脑内的重要存在形式，主要是星形胶质细胞分泌的。1966年Oskai等[8]首先提出CP在铁代谢中的主要作用是协助铁释放。临床上无铜蓝蛋白血症(aceruloplasminemia, ACP)的患者和CP基因全身敲除(CP-/-)的小鼠都出现了脑铁的沉积，支持了CP具有帮助铁释放功能的学说[9,10]。

ACP是由于CP基因突变引起的，主要特征是脑铁沉积和神经退行性变，如小脑共济失调、亨廷顿舞蹈症、帕金森病和认知功能障碍[11]。CP-/-成年小鼠也同样在脑内出现铁沉积，也出现了脂质过氧化反应[10,12]。这些结果表明，CP在体情况下，能阻止铁的积累。此外，CP对于铁进入脑细胞也起着很重要的作用，也有人认为，CP帮助细胞摄取铁的功能比释放铁的功能更重要[6]。如果以上提及的是正确的，为什么在ACP的患者和CP-/-的小鼠会出现铁的沉积呢?CP基因突变或者缺乏CP基因时，推测可能因CP基因的缺失，导致亚铁氧化酶功能降低，不能将Fe2+转化成Fe3+,与转铁蛋白结合的铁含量相对降低，而以枸橼酸铁、抗坏血酸铁等非转铁蛋白结合铁(non-transferrin binds iron, NTBI)的方式获取铁，同时，细胞铁的释放可能降低，过量的铁沉积在神经元中，引起氧化应激和产生自由基。

为了解CP在中枢神经系统中维持铁稳态的作用机制，我们制备了CPGFAPcKO的小鼠，主要是因为在脑中，CP蛋白主要是星形胶质细胞分泌的。这种小鼠的皮层和海马区铁水平降低，而肝脏铁和血清铁没有变化，证实我们敲除的只是中枢神经系统的CP基因，并没有影响外周的CP基因。为了证实我们敲除的是星形胶质细胞的CP基因，通过免疫荧光双标的方法，证明了敲除组星形胶质细胞和CP蛋白很少有共定位，说明星形胶质细胞表达的CP明显降低，模型建立成功。我们制备的6月龄星形胶质细胞特异性敲除CP基因的小鼠，皮层和海马的铁水平降低。有文献报道，3～4月龄CP-/-小鼠海马铁水平也降低[13],这和我们的结果相一致，证实了CP的主要功能是协助脑细胞摄取铁。

我们实验所用的星形胶质细胞敲除CP的小鼠为什么皮层和海马区铁降低，与ACP和全身敲除CP的结果正好相反，可能的原因是本实验所用的小鼠相对年轻，我们还做了18月龄的老年小鼠的实验，在皮层和海马区铁出现了沉积。研究发现，铁主要积累在星形胶质细胞中，导致星形胶质细胞形态的异常或畸形，过量的铁造成了对星形胶质细胞的氧化损伤。因为星形胶质细胞缺乏GPI-CP,它不能将铁转运给神经元，所以，神经元早期会因为铁缺乏而出现缺失，后期神经元以非转铁蛋白结合铁的方式获取铁，引起铁的沉积。

我们用Morris水迷宫实验检测6月龄小鼠的学习和记忆能力。CPGFAPcKO的小鼠潜伏期明显增加，在目标象限停留时间百分比和穿过平台的次数都明显降低。结果提示，星形胶质细胞敲除CP,损伤了小鼠的学习和记忆能力。研究表明，星形胶质细胞表达的CP对于少突胶质细胞的发育与髓鞘化至关重要[14]。铁缺乏可影响少突胶质细胞的成熟，导致髓鞘减少[15],同时会引起脑中参与识别记忆处理的区域出现异常的蛋白质折叠，以及空间学习缺陷[3]。为了研究空间学习和记忆改变的原因，我们检测了脑铁水平，结果显示，星形胶质细胞敲除CP后，在皮层区和海马区铁分布、含量都明显降低，这些结果支持了正常的脑铁代谢对于大脑发育起到重要作用。

铁存在于中枢神经系统的大多数细胞中。但是，少突胶质细胞能获得比脑中其他细胞更多的铁，用于髓鞘的生成[16]。铁缺乏还会影响少突胶质细胞获得铁作为参与脂质和胆固醇合成酶的辅因子，导致少突胶质细胞数量、分化、髓鞘组成的变化，严重时引起动物和人类的脱髓鞘，进而影响它的行为[17～19]。神经元对缺铁也非常敏感，缺铁引起树突形态异常，电生理活动降低，进而影响学习、记忆和心理社会能力[20]。

星形胶质细胞敲除CP基因后，小鼠的学习记忆能力明显降低，可能是皮层和海马区铁水平明显降低引起的。而铁降低可能会影响突触、髓鞘的形成，以及神经递质的合成。因此，我们下一步可以检测皮层和海马区和记忆有关的突触蛋白，以及通过电子显微镜来观察髓鞘的形态并且检测神经递质的含量，进一步探索小鼠学习记忆下降可能的机制。

参考文献:

[1]于鹏,段相林,张明,等.高铁对大鼠大脑皮层二价金属转运蛋白1表达的影响[J].解剖学报,2011,42(4):435-440.

基金资助:承德医学院高层次人才科研启动基金(202203);承德医学院人体解剖学与组织学胚胎学优势学科资助项目(202302);

文章来源:李海艳,李忠达,何立娟.星形胶质细胞敲除铜蓝蛋白对小鼠脑铁代谢的影响[J].解剖学报,2024,55(04):475-481.