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STIP1在脑胶质瘤细胞株增殖、凋亡、侵袭的影响

2020-10-13 616 上传者：管理员

摘要：目的:检测磷酸化应激诱导蛋白在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达差异,探讨STIP1对胶质瘤细胞株U87、U251细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法:运用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、免疫组化及蛋白印迹检测胶质瘤组织和正常脑组织中STIP1的表达;小干扰RNA(STIP1-siRNA)转染U87、U251细胞株后,使用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞仪和Transwell小室观察细胞的增殖、凋亡和侵袭能力。结果:STIP1在胶质瘤Ⅳ级组织中的表达明显高于正常脑组织,但在胶质瘤Ⅱ、Ⅲ级中的表达与正常脑组织无明显差异。U87、U251细胞株转染STIP1-siRNA后,细胞增殖和侵袭能力明显受到抑制,而细胞凋亡率明显上升。结论:STIP1在胶质母细胞瘤组织中高表达,下调STIP1可以抑制胶质瘤细胞株U87和U251的增殖,阻滞细胞周期,促进其细胞凋亡,并可抑制其侵袭力。

关键词：
STIP1
侵袭
凋亡
增殖
头颈肿瘤
细胞株
胶质瘤
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神经胶质瘤是起源于神经胶质细胞谱系的中枢神经系统原发性恶性肿瘤,占颅内原发性恶性肿瘤的46.6%[1],为最常见的颅内原发恶性肿瘤,具有高发病率、高死亡率等特点。其治疗困难,预后差,尤其胶质母细胞瘤,即使接受正规治疗,5年生存率仅为2.4%～4.6%[2]。基因和免疫治疗等为胶质瘤提供新的治疗途径。磷酸化应激诱导蛋白的主要生物学功能是作为热休克蛋白Hsp70和Hsp90的连接分子[3],与其结合形成复合体。近期研究表明,磷酸化应激诱导蛋白参与多种肿瘤细胞的发生、发展[4]。本研究旨在检测磷酸化应激诱导蛋白1在胶质瘤细胞中的表达特性,检测对胶质瘤细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1组织标本

人脑胶质瘤、非瘤脑组织标本(液氮冷冻保存)取自于2012年1月至2017年12月苏州大学附属第一医院神经外科手术切除,且均经病理证实。胶质瘤35例,包括13例低级别胶质瘤组织(WHOⅡ级,少突胶质细胞瘤2例,星形细胞瘤11例)和22例高级别胶质瘤组织(其中WHOⅢ级11例,间变性少突胶质细胞瘤1例,星形细胞瘤7例,间质室管膜瘤3例;WHOⅣ级即胶质母细胞瘤11例);非瘤脑组织(正常脑组织)6例。

1.1.2胶质瘤细胞株及主要试剂

人脑胶质瘤细胞株U87、U251购于中国上海生命科学院生物细胞研究所。细胞培养基(DMEM,美国Thermo公司);胎牛血清(FBS,美国Gibco公司);定量PCR试剂盒(美国Thermo公司);免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术开发公司);STIP1引物、内参照(上海生工生物工程有限公司);带有绿色荧光蛋白(GFP)的STIP1-小干扰RNA(siRNA)(吉玛基因股份公司合成。siRNA-1:GCTACTCCGAAGCTATTAAGC;siRNA-2:GCCAGAGCCAATGGAAGAAGA;siRNA-3:GGAGACTACCAGAAGGCTTAT);STIP1等抗体(美国Abcam公司);Transwell小室(Corning公司)。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR分析STIP1在组织标本中的表达水平

按照Trizol说明书提取总RNA,用反转录试剂盒逆转录成cDNA,进行qRT-PCR方法扩增。循环条件为95℃、30s,60℃、30s,72℃、30s,共40个循环;60℃延长5min。相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.2.2免疫组化

组织标本取材并用10%福尔马林固定后,用酒精、二甲苯脱水透明,浸泡石蜡包埋,切片3～5mm并贴片。严格按照试剂盒说明书行脱蜡、水化,组织抗原修复,阻断内源性过氧化物酶,加入兔多克隆抗体STIP1一抗过夜,然后加入羊抗兔二抗,显色,复染等。

1.2.3蛋白印迹检测蛋白表达水平

RIPA裂解液裂解组织或细胞蛋白,利用BCA试剂盒调平各组提取的蛋白浓度。制胶30μg蛋白上样,60V电压跑30min,100V电压跑完全程;湿转法转膜,60V恒压电转2h,丽春红染色,5%脱脂牛奶的PBS中,37℃封闭1h。一抗4℃过夜孵育,TBST洗涤三次加入二抗37℃孵育1h。TBST再次洗涤后滴加发光显色液曝光显色,GAPDH作为内参。

1.2.4细胞培养和转染

10%胎牛血清的DMEM培养液于5%CO2、37℃恒温箱细胞培养。将胶质瘤细胞株(U87、U251)接种6孔板中,实验分为空白对照(blank)、阴性对照(NC)、STIP1-siRNA转染组,转染后培养48～72h。显微镜观察转染效率。

1.2.5MTT法和流式细胞仪检测细胞增殖及凋亡周期

转染24h后将空白对照、阴性对照、STIP1-siRNA转染组三组制备成单细胞悬液,2×104个细胞/mL,将细胞悬液100μL加入96孔板一孔中,每组设3个复孔,培养箱孵育,分别在12h、48h、60h、72h酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的光密度,比较细胞增殖。将转染后的细胞株用胰酶消化,PBS洗涤,再加入1mL70%乙醇,4℃过夜。PBS洗涤过夜细胞,加入碘化丙啶染色液与RNaseA以及染色缓冲液,缓慢并充分重悬细胞沉淀,37℃避光温浴30min,应用流式细胞仪检测细胞周期分布。三组单细胞悬液经PBS洗涤,用细胞凋亡检测试剂盒(AnnexinVPEApoptosisDetectionKit)染色后,行流式细胞仪检测(严格按照细胞凋亡检测试剂盒的说明书进行)。

1.2.6Transwell小室检测细胞侵袭能力

空白对照、阴性对照、STIP1-siRNA转染组三组无血清培养基培养后,接种于Transwell小室上,小室上层3×103个/孔,培养箱中孵育48h。湿棉签擦除上层细胞,4%多聚甲醛固定30min,0.1%结晶紫染色1min,高倍镜下随机取6个视野计数,取平均数。重复3次。

1.3统计学处理

采用SwithGraphPadPrism5进行统计分析。应用SPSS21.0统计软件分析,计量资料采用均数±标准差(x¯±s)表示,两组间比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1STIP1在胶质瘤组织及正常脑组织中的表达

通过qRT-PCR检测35例不同级别胶质瘤标本及6例正常脑组织中STIP1基因表达水平,结果显示在胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)组织中,STIP1的表达明显高于正常脑组织,但是Ⅱ、Ⅲ级胶质瘤组织中的表达与正常脑组织无明显差异。免疫组化及蛋白印迹证实胶质母细胞瘤中STIP1的表达明显高于正常脑组织(图1)。

图1STIP1在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达

A:不同级别胶质瘤(Ⅱ级、Ⅲ级、GBM)与正常脑组织(NBT)中STIP1mRNA表达差异(与正常脑组织相比,**P<0.01);B:免疫组化检测胶质母细胞瘤与正常脑组织中STIP1蛋白表达差异;C:蛋白印迹检测胶质母细胞瘤与正常脑组织中STIP1蛋白表达差异。

2.2STIP1-siRNA转染效率测定及优势序列选取

三条可供选择的siRNA(siRNA-1、2、3)分别转染U87、U251细胞株。荧光显微镜观察三种siRNA转染细胞的效率均超过90%。利用蛋白印迹技术,三种siRNA转染组分别与空白对照组相比,在U87细胞株中STIP1的表达均有下降、其中siRNA-3最为明显,在U251细胞株中siRNA-3转染组STIP1表达明显下降(图2)。因此选择最佳干扰序列siRNA-3用于后续实验。

2.3下调STIP1对U87、U251细胞株增殖及凋亡的影响

MTT法检测转染STIP1-siRNA后在12h、48h、60h、72h的细胞增殖情况,结果显示转染STIP1-siRNA即STIP1下调后明显抑制胶质瘤细胞株生长,增殖减慢。流式细胞仪检测STIP1下调组、空白对照组、阴性对照组细胞周期进展和凋亡情况。三次重复实验,STIP1下调组与空白对照组和阴性对照组相比,G1期细胞周期增加。同时STIP1下调后出现明显的凋亡峰,与空白对照组和阴性对照组相比,凋亡比例明显增加(图3)。

2.4下调STIP1对U87、U251细胞株侵袭的影响

Transwell实验观察到转染STIP1-siRNA后的胶质瘤细胞株U87、U251穿膜细胞数明显减少,表示侵袭能力明显降低(图4)。

3、讨论

胶质瘤发病率高,治疗效果较差,其主要治疗方式为手术切除治疗,但因肿瘤呈浸润性生长,完全切除较为困难,手术切除后残留的肿瘤细胞具有迁移和侵袭周围组织的能力,大多数肿瘤在原始切除部位的2cm边缘内复发[5]。手术后的炎症和修复活性可能会刺激其余肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[6]。同样,放疗会引起颅内炎症反应,这也可能会刺激残存的肿瘤细胞,而大多数弥漫性神经胶质瘤对化疗的反应较差。近年来在神经胶质瘤中最重要的发现之一是IDH1和IDH2基因突变[7,8],IDH基因所编码的蛋白为异柠檬酸脱氢酶,是三羧酸循环的关键酶,IDH1/2突变是胶质瘤预后良好的指标。胶质瘤细胞已被证实可利用谷氨酰胺进行生物合成,因此干扰谷氨酰胺的代谢被认为是胶质瘤潜在的治疗靶点[9,10]。越来越多的研究倾向于基因组学探索胶质瘤治疗新靶点。近年来,STIP1基因在恶性肿瘤研究中备受关注。

STIP1是HSP70/HSP90分子复合物的伴侣蛋白。HSP家族参与恶性肿瘤的发生与发展[11]。多研究表明STIP1在肺癌[4]、胰腺癌[12]、肝癌[13]、甲状腺癌[14]、结直肠癌[15]等肿瘤中异常表达并与肿瘤发生发展相关。研究发现STIP1在胶质瘤中异常表达,并且与胶质瘤的进展相关,其具体机制不详[16,17]。

图2转染效率测定及最佳siRNA选取

A:荧光显微镜观察转染效率(×400);B:三条siRNA转染后,Western-blot检测STIP1蛋白的表达水平(与空白对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

图3下调STIP1对胶质瘤细胞株U87、U251增殖及凋亡的影响

A:STIP1-siRNA转染后12h、48h、60h、72h细胞增殖情况;B:流式细胞仪分析转染STIP1-siRNA的细胞以及空白对照组和阴性对照组的细胞周期进展和凋亡情况;C:下调STIP1后，与空白对照组、阴性对照组相比的细胞周期分布;D:下调STIP1后，与空白对照组、阴性对照组相比的G1期分布比和凋亡比。与对照组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图4Transwell检测转染后U87、U251各组细胞的侵袭能力

A:各组细胞穿膜细胞状态(结晶紫染色×400);B:各组细胞穿膜细胞数的对比(与对照组相比,**P<0.01)。

在我们的研究中,通过qRT-PCR检测发现STIP1在低级别胶质瘤组织与正常脑组织表达无明显差异、在胶质母细胞瘤组织中的表达明显高于正常脑组织,并通过蛋白印迹和免疫组化验证,这说明在胶质母细胞瘤中STIP1基因水平的表达明显高于正常脑组织,同时验证蛋白与基因表达相符合。不同级别的胶质瘤,STIP1在基因和蛋白水平表达存在差异,其原因为该基因编码在不同级别胶质瘤中存在差异,从而影响其相关蛋白表达,进而在肿瘤中发挥生物学特性。因此提示STIP1在脑胶质瘤的发生和发展过程中可能属于功能性基因。在胶质瘤细胞株中,下调STIP1的表达,MTT实验证实胶质瘤细胞株增殖活性明显下降,流式细胞仪证实细胞凋亡率增加,同时Transell小室证实其穿透侵袭能力下降,以上结果均提示STIP1在胶质母细胞瘤的发生和发展中起着促进作用,推测STIP1在脑胶质瘤细胞中具有类似原癌基因的活性。

综上所述,STIP1在高级别胶质瘤中呈高表达;下调STIP1后将抑制胶质瘤细胞株增殖、侵袭,促进其凋亡。因此STIP1有望成为神经胶质瘤的诊断和治疗新的靶点,为脑胶质瘤靶向药物的研发提供新的方向。

赵安静,殷洪伟,李学涛,孙春明.STIP1在脑胶质瘤组织中的表达及对胶质瘤细胞株增殖、凋亡、侵袭的影响[J].现代肿瘤医学,2020,28(21):3661-3665.