术后认知功能障碍是麻醉、术后引发的中枢神经系统疾病，常发于新生儿，脑内促炎因子的增加、神经元细胞异常凋亡等均为认知功能障碍的危险因素[1]。资料显示在美国每年约有600万儿童接受外科手术治疗，多次接触麻醉剂及手术治疗的儿童患认知功能障碍的风险较大，这使得麻醉剂的安全性成为人们关注的主要问题[2]。七氟醚是临床中常用的麻醉剂，因其具有术中血流力学稳定、术后苏醒快等优点而得到广泛应用，已有研究表明七氟醚可破坏大鼠血脑屏障完整性、引起神经炎症、诱导海马神经元凋亡等作用，对大鼠的认知功能具有负面影响[3-4]。神经调节蛋白1(Neuregulin1,NRG1）是神经调节素（Neuregins,NRGS）家族成员，主要通过促进ErbB受体磷酸化发挥作用，受体蛋白酪氨酸激酶（Receptor protein‐tyrosine kinase erbB‐4,ErbB4）属于ErbB受体家族，与NRG1亲和度较高，资料显示NRG1/ErbB4通路在中枢神经系统、外周神经系统调节中发挥重要作用[5]。Hao等[6]研究显示NRG1/ErbB4通路的激活在改善慢性脑低灌注鼠的空间认知功能障碍及保护神经功能等方面发挥重要作用。李晓敏[7]研究结果显示异氟醚吸入可导致鼠海马组织中NRG1/ErbB4信号通路功能下降，进而引发鼠海马组织损伤及认知功能障碍。因此，本研究在前人研究的基础上探讨NRG1/ErbB4通路在七氟醚诱导的大鼠认知功能障碍中的作用。

1、材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

48只SPF级雄性7日龄SD大鼠，体质量约20 g，购于广东省医学实验动物中心，使用许可证号：SYXK（粤）2018-0002，生产许可证号：SCXK（粤）2018-0002。在控制环境温度（24±2）℃和40%～70%湿度的条件下，将所有动物饲养在单独的笼子中，光照/黑暗循环12 h。所有动物实验方案均经本院动物护理与使用委员会批准（文号202212009）。

1.1.2 主要试剂及仪器

NRG1‐β1(NRG1类似物，P5700）蛋白提取试剂盒（批号P0027）、BCA试剂盒（批号P0011）（上海碧云天），AG1478(ErbB4受体阻断剂，批号153436‐53‐4）（美国MCE),HE染色试剂盒（批号E607218‐0200）（上海生工），DAB显色试剂盒（批号DA1015）、TNF‐α（批号：SEKR‐0009）、IL‐1β（批号SEKR‐0002）、IL‐6 ELISA试剂盒（批号SEKR‐0005）（北京索莱宝），兔源Ca‐pase‐3、Bax、NRG1、ErbB4一抗、羊抗兔IgG二抗（批号分别为ab184787、ab32503、ab191139、ab109273、ab6721）（英国Abcam）；生物组织脱水机（DB‐680C）（孝感市德比电子）、光学显微镜（DMD108，德国徕卡）、组织匀浆机（XINW‐M48，上海鑫翁科学）、酶标仪（AMR‐100，杭州奥盛仪器）、凝胶成像仪（UVP Gelstudio touch，德国耶拿），等。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、侧脑室注射及七氟醚麻醉

将48只大鼠按照随机数字法分为对照组、七氟醚组、七氟醚+NRG1‐β1(NRG1类似物）组、七氟醚+NRG1‐β1+AG1478(ErbB4受体阻断剂）组，每组12只。大鼠麻醉后将其呈仰卧位放置，然后固定在脑定位仪上，气管插管后连接小动物呼吸机，并维持大鼠体温在37℃左右。对照组及七氟醚组侧脑室注射5μL生理盐水，七氟醚+NRG1‐β1组侧脑室注射5μLNRG1‐β1(5μg/kg)[8]，七氟醚+NRG1‐β1+AG1478(ErbB4受体阻断剂）组侧脑室注射5μL NRG1‐β1(5μg/kg）及AG1478(2.5μg/只）[9]。依据参考文献和图谱[10‐11]将大鼠左侧脑室坐标定为：颅骨下2.4 mm，中线左0.8 mm，前囱后0.6 mm，注射速度2μL/min，留针1 min。侧脑室注射完成后10 min，除对照组吸入空气氧气混合气体外，其余各组大鼠通过气管导管吸入4%七氟醚、30%氧气的混合气体1 h，氧流量2 L/min[12]。

1.2.2 大鼠认知功能测定

大鼠喂养至第14天，用Morris水迷宫实验检测各组大鼠认知功能[13]，主要包括定位巡航和空间探索实验。将水迷宫测试仪圆形水池温度设置为25℃左右，水池等分为1、2、3、4象限，将透明圆形平台（半径为5 cm）置于第1象限中央并低于水面1 cm进行定位巡航实验：每天上下午在每个象限的固定入口点，按随机顺序将大鼠随机放入水中，将大鼠在水中搜寻和爬上平台的持续时间记录为潜伏期。该值越低，大鼠的认知功能越好。若90 s内未找到平台，将其引导至平台并停留15 s，潜伏期记为90 s。每天训练4次，连续训练5 d。记录每天检测结果的平均值。每次训练之间有60 s的间隔。

空间探索实验：第5天结束时，将圆形平台撤去，24 h后使用各自的对角线象限将大鼠放入面向水箱壁的水中。利用ANYmaze视频跟踪系统记录和分析大鼠每天的游泳速度（m/s）、游过平台区域的次数以及子啊目标象限的停留时间。

1.2.3 大鼠海马组织标本采集

Morris水迷宫实验结束后，将大鼠麻醉后处死，消毒后将脑部皮肤、肌肉、骨膜依次切开，暴露脑组织，并用手术刀分离海马组织，6只用于苏木精‐伊红（HE）染色观察及TUNEL神经元细胞凋亡情况检测，6只用于其中炎症因子测定、凋亡相关蛋白及NRG1/ErbB4通路相关蛋白测定。

1.2.4 大鼠海马组织HE染色及TUNEL检测

取1.2.3中大鼠海马组织，用4%的多聚甲醛固定48 h。将多聚甲醛固定的海马浸泡在不同浓度的酒精中（70%、80%、90%、95%和100%），用二甲苯渗透，石蜡包埋，用切片机切片成4μm厚的切片。切片脱蜡，苏木素染色5 min,PBS洗涤，1%酒精盐酸分化，伊红染色30 s，然后通过分级酒精系列脱水，封片后于显微镜下观察，随机选取海马CA1区3个野区拍照，并用自动形态测量仪测量每组海马神经元表面积5次，取平均值。对4μm石蜡切片进行脱蜡、渗透和密封。用50μL TUNEL反应液处理后，切片在37℃的湿暗箱中孵育1 h，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后加入转化剂继续反应30 min，磷酸缓冲盐溶液冲洗，加入DAB显色液，荧光显微镜下观察，每个切片随机选取5个视野。以棕褐色细胞与视野总细胞的百分比表示神经元细胞凋亡率。

1.2.5 大鼠海马组织中炎症因子水平测量

大鼠海马组织在组织匀浆机中匀浆，4℃、3000 rpm离心10 min。按照TNF‐α、IL‐1β、IL‐6 ELISA试剂盒的制造商说明处理上清液，并根据标准曲线计算TNF‐α、IL‐1β、IL‐6的水平。

1.2.6 大鼠海马组织凋亡相关蛋白及NRG1/ErbB4通路蛋白表达检测

海马组织样品用蛋白质提取试剂盒提取总蛋白质，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。取各组大鼠海马组织蛋白液加热变性，待其冷却后进行聚丙酰胺凝胶电泳，然后将分离的蛋白转移到PVDF膜上，室温下用脱脂奶粉阻断膜2 h。加入兔源Capase‐3(1∶100）、Bax(1∶100）、NRG1(1∶500）、ErbB4(1∶500）、p‐ErbB4(1∶500）、β‐Actin(1∶1 000）一抗，4℃孵育过夜。接下来，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜，加入辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG二抗，室温孵育2 h。显色曝光后在凝胶成像仪中分析。以β‐Actin作为内对照，将目标条带与内对照条带的灰度值比值定义为相对蛋白水平。每个样本重复检测3次。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 23.0软件进行分析，以均数±标准差（Mean±SD）表示。组间比较进行单因素方差分析，随后采用LSD‐t事后检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组大鼠认知功能比较

七氟醚组与对照组相比，大鼠潜伏期明显增高，穿台次数和目标象限停留的时间明显减少（P<0.05）；与七氟醚组相比，七氟醚+NRG1‐β1组、七氟醚+NRG1‐β1+AG1478组大鼠潜伏期显著降低（P<0.05），穿台次数和目标象限停留的时间显著增多（P<0.05）；与七氟醚+NRG1‐β1组相比，七氟醚+NRG1‐β1+AG1478组大鼠潜伏期显著升高（P<0.05），穿台次数和目标象限停留的时间显著减少（P<0.05）。各组大鼠的平均游泳速度差异无统计学意义（P>0.05）（表1、表2）。

表1 各组大鼠潜伏期不同时间比较（s,Mean±SD)

表2 各组大鼠穿台次数、目标象限停留的时间、游泳速度比较（Mean±SD)(n=12)

2.2 各组大鼠海马组织病理学观察

对照组大鼠海马组织神经元细胞排列整齐、染色均匀；七氟醚组与对照组相比，海马组织神经元细胞排列紊乱且疏松，出现细胞核固缩及细胞坏死等现象；与七氟醚组相比，七氟醚+NRG1‐β1组及七氟醚+NRG1‐β1+AG1478组大鼠海马组织受损得到缓解；与七氟醚+NRG1‐β1组相比，七氟醚+NRG1‐β1+AG1478组大鼠海马组织受损严重（图1）。

对照组、七氟醚组、七氟醚+NRG1‐β1组和七氟醚+NRG1‐β1+AG1478组海马神经元细胞表面积分别为（687.45±32.56）μm2、（358.24±13.61）μm2、（569.82±27.89）μm2、（474.65±23.18）μm2，且各组海马神经元细胞的表面积之间的差异有统计学意义（F=183.456,P=0.000）。

图1 各组大鼠海马CA1区病理观察（HE染色，×400)

2.3 各组大鼠海马组织神经元细胞凋亡比较

七氟醚组与对照组相比，海马组织神经元凋亡率及凋亡相关蛋白（Capase‐3、Bax）表达显著升高（P<0.05）；与七氟醚组相比，七氟醚+NRG1‐β1组、七氟醚+NRG1‐β1+AG1478组海马组织神经元凋亡率、凋亡相关蛋白（Capase‐3、Bax）表达显著降低（P<0.05）；与七氟醚+NRG1‐β1组相比，七氟醚+NRG1‐β1+AG1478组海马组织神经元凋亡率、凋亡相关蛋白（Capase‐3、Bax）表达显著升高（P<0.05）（图2、图3，表3）。

2.4 各组大鼠海马组织中炎症因子水平比较

与对照组相比，七氟醚组海马组织IL‐1β、TNF‐α、IL‐6水平明显增加（P<0.05）；七氟醚+NRG1‐β1组、七氟醚+NRG1‐β1+AG1478组与七氟醚组相比，海马组织TNF‐α、IL‐1β、IL‐6水平显著降低（P<0.05）；与七氟醚+NRG1‐β1组相比，七氟醚+NRG1‐β1+AG1478组海马组织TNF‐α、IL‐1β、IL‐6水平显著升高（P<0.05）（表4）。

图2 各组大鼠海马CA1区神经元凋亡情况比较（TUNEL染色，×400)

图3 各组大鼠海马神经元凋亡相关蛋白表达情况

表3 各组大鼠海马组织神经元凋亡情况比较（Mean±SD)(n=6)

2.5 各组大鼠海马组织NRG1/ErbB4通路相关蛋白表达比较

与对照组相比，七氟醚组海马组织NRG1/β‐Actin、p‐ErbB4/ErbB4水平显著降低（P<0.05）；与七氟醚组相比，七氟醚+NRG1‐β1组、七氟醚+NRG1‐β1+AG1478组海马组织NRG1/β‐Actin、p‐ErbB4/ErbB4水平显著升高（P<0.05）；与七氟醚+NRG1‐β1组相比，七氟醚+NRG1‐β1+AG1478组海马组织NRG1/β‐Actin无明显变化（P>0.05),p‐ErbB4/ErbB4水平显著降低（P<0.05）（表5、图5）。

表4 各组大鼠海马组织炎症因子水平比较（Mean±SD)(n=6)

表5 各组大鼠海马组织NRG1/ErbB4通路相关蛋白表达比较（Mean±SD)(n=6)

3、讨论

中国每年接受外科手术的儿童有数百万人，外科手术中麻醉剂等中枢作用药物的使用常会导致患者发生术后认知功能障碍，严重影响患者的学习、记忆、认知等能力，给社会及患者家庭带来沉重负担[14]。深入研究麻醉药物对认知功能的影响是外科手术中安全使用麻醉药的关键。海马组织是大脑边缘组织的重要组成部分，是人学习、记忆的关键部位，海马神经元的异常凋亡、炎症反应、氧化应激等均可导致认知功能障碍的发生[15]，海马组织中含有大量促炎细胞因子受体，当海马组织受到损伤时，促炎细胞因子会大量释放，持续的慢性炎症反应会导致持续性认知功能衰退[16-17]。

图4 各组大鼠海马组织NRG1/ErbB4通路相关蛋白表达比较

七氟醚是一种常用吸入全身麻醉药，在儿科病人中得到了广泛的应用，多项研究表明七氟醚可通过诱导海马神经元细胞凋亡、促进神经炎症反应等引发认知功能障碍，Jiang等[18]研究发现新生鼠多次接触七氟醚可导致海马组织体积减少、学习记忆能力显著降低，Xu等[19]研究发现一次性七氟醚麻醉可引发新生儿大鼠海马组织损伤并导致认知功能障碍。本研究结果显示，与对照组相比，七氟醚组大鼠认知功能显著降低，海马组织神经元细胞排列疏松且紊乱，出现细胞核固缩及细胞坏死等现象，神经元凋亡率、炎症因子水平及蛋白Capase‐3、Bax表达明显增加，表明七氟醚可引发大鼠海马组织炎症反应、诱导神经元细胞异常凋亡并引起大鼠认知功能障碍。

近年来有关NRG1/ErbB4通路在神经系统疾病中的作用成为研究热点，NRG1主要分布于神经系统，在调控神经细胞的迁移、神经递质受体的表达、神经传递、突触发生、髓鞘形成中发挥重要作用，对氨基丁酸能神经、多巴胺能神经功能具有一定的调节作用，ErbB4是NRG1的特异性受体，具有自主性，主要通过酪氨酸激酶与NRG1结合，NRG1可促进ErbB4磷酸化，进而对海马神经元产生影响[20-21]。资料显示ErbB4磷酸化降低参与了肌萎缩侧索硬化/额颞部痴呆等神经退行性疾病的发生[22]。Niu等[23]研究发现NRG1/ErbB4通路的激活可显著改善慢性脑低灌注引起的大鼠认知功能障碍，并在保护大鼠的神经元和突触等方面具有积极作用。Deng等[24]研究发现NRG1/ErbB4通路可减轻创伤性脑损伤后的皮层神经元细胞死亡。本研究结果显示，与对照组相比，七氟醚组大鼠海马组织NRG1、p‐ErbB4水平显著降低，提示NRG1/ErbB4通路活性降低可能与七氟醚诱导的大鼠认知功能障碍存在某种联系，我们猜测七氟醚可能抑制NRG1活化，进而降低其受体ErbB4的磷酸化水平，最终起到抑制NRG1/ErbB4通路的作用；与七氟醚组相比，七氟醚+NRG1‐β1组、七氟醚+NRG1‐β1+AG1478组大鼠海马组织NRG1、p‐ErbB4水平显著升高，与七氟醚+NRG1‐β1组相比，七氟醚+NRG1‐β1+AG1478组大鼠海马组织p‐ErbB4水平显著降低，提示激活NRG1/ErbB4通路可能通过减少海马组织损伤、神经元细胞凋亡、抑制炎症反应来改善大鼠认知功能障碍。基于上述研究结果，我们认为NRG1可能是预防和治疗七氟醚诱导认知功能障碍的靶点。

综上所述，NRG1/ErbB4通路在七氟醚诱导大鼠认知功能障碍中发挥重要作用，激活NRG1/ErbB4通路可抑制七氟醚诱导大鼠神经炎症反应及神经细胞凋亡，并改善七氟醚诱导的大鼠认知功能障碍。本文以新生大鼠为研究对象探讨七氟醚对认知功能障碍的影响，并从炎症和神经元凋亡角度分析导致认知功能障碍的原因，以及NRG1/ErbB4通路对七氟醚致大鼠认知功能障碍的改善作用均是本文的创新之处。但是，本研究发现NRG1类似物干预后并未阻断七氟醚对新生大鼠认知功能障碍的作用，推测七氟醚对认知功能障碍的诱导机制十分复杂，需要更加深入的研究。

参考文献:

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基金资助:上海市浦江人才计划(21PJD066);

文章来源:于绍勇,傅麟,俞洪韵,等.NRG1/ErbB4通路在七氟醚诱导大鼠认知功能障碍中的作用[J].解剖学研究,2024,46(04):303-309.