酿酒酵母是一类能够发酵糖类的单细胞真核微生物的总称，是第一个完成基因组测序的单细胞真核生物，发酵工艺成熟，生物安全性高，目前的研究较为透彻[1-2]。首先，酵母细胞能够利用自配置的YPD培养基培养，而且较容易控制它的生长。其次，易操作性和较高的生长速度以及具有很强的保真性和稳定性，使得酵母细胞成为较好的生物模型。此外，酿酒酵母在日常生活中常用来制作面包和馒头等，是与人类关系最为广泛的一种酵母，被广泛运用于食品、医药等领域。

细胞骨架主要由微丝、微管和中间丝构成[3-4]，是通过蛋白质纤维组成的细胞结构和功能的网架结构，主要参与细胞的运动、分裂、分化以及物质运输、能量转化、信息传递等生命活动[5]。此外，由于酿酒酵母细胞骨架中含有Septin等GTP-结合蛋白，因此，可以通过研究细胞骨架的变化以说明细胞骨架相关蛋白的调控的异常情况。在酿酒酵母细胞BY4742生长过程中，进行毒性化合物暴露，可能诱发骨架造成异常，进而影响细胞的功能异常。细胞核作为细胞的控制中心，对细胞的生长和分裂至关重。邻苯二甲酸二辛酯能引起染色体丢失或断裂[6]，而染色体断裂或者丢失情况可导致细胞核形态等出现异常。细胞凋亡是细胞为了维持自身内环境稳定而自主调控的有序死亡，毒性物质作用下会加快间质细胞凋亡[7]。邻苯二甲酸二辛酯暴露可使细胞被阻滞在G0/G1期[8]。因此，可以通过观察细胞骨架、细胞核、细胞凋亡的异常情况以评价化合物的毒性作用。

邻苯二甲酸二辛酯（DEHP）广泛存在于人类日常生活中，是一类低毒类的物质，但其很容易在人体内滞留，造成慢性毒害作用。例如，长期暴露于邻苯二甲酸二辛酯的工作环境，会对人体的内分泌系统造成干扰，如DEHP会诱导睾丸毒性，进而影响睾酮水平和血液睾酮屏障（BTB）完整性，引起体内铁死亡[9]。此外，作为一种环境内分泌干扰物，DEHP暴露会对机体造成不同程度的影响。有研究表明，DEHP暴露破坏了神经发生和神经祖细胞迁移，从而影响人脑的神经发育[10]。并且，DEHP是一类对人体器官、细胞、组织等各方面均有较大影响的物质。相关研究也表明，DEHP的暴露对于人体细胞、大鼠卵巢睾丸颗粒细胞及肝脏细胞、植物培根细胞等方面均具有毒性作用。本研究通过DEHP暴露对酿酒酵母细胞生长、凋亡、骨架异常等情况来探讨DEHP的毒性作用，为DEHP的毒性作用机制的研究提供了基础。

1、材料与方法

1.1 细胞株来源、仪器与试剂

酿酒酵母BY4742细胞（美国Invitrogen公司），Allegra X-30低温高速离心机（美国贝克曼库尔特公司），Synergy H1多功能酶标仪（美国BioTek公司），LightCycler96实时荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司），Ts2R-FL荧光显微镜（日本Nikon公司），DEHP（优级纯，北京索莱宝科技有限公司），鬼笔环肽（美国Sigma-Aldrich公司），RNA提取试剂盒和cDNA合成试剂盒（北京天根生物科技公司），qPCR引物（上海生工生物工程有限公司）。

DEHP染毒溶液的配制：准确量取适量的DEHP溶于液体培养基，制成浓度依次为100 mg/L、10 mg/L、1.00 mg/L的DEHP溶液。

酵母浸出粉胨葡萄糖液体（YPD）培养基：含有2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物；固体培养基：含有2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物、琼脂糖（1.5%）。

1.2细胞培养方法

将酿酒酵母BY4742细胞接种于盛有自配制YPD培养基（含2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物）的培养基中，于180 r/min、30℃条件下摇床培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3细胞活性的测定

取适量处于对数生长期酵母BY4742细胞接种到5 ml的YPD液体培养基中，于30℃、以180 r/min在摇床中活化24 h，然后吸取400μl菌液，调整细胞密度为3×107个/ml，分别接种到含邻苯二甲酸二辛酯浓度为0.0 mg/L（对照）、1.0 mg/L、10.0 mg/L、100.0 mg/L的YPD培养基的96孔板中，置于30℃恒温振荡器中振荡培养24 h后，于600 nm处测定吸光度（A）值，并计算相对生长率（相对生长率=处理组A值/对照组A值×100%）。

1.4 细胞耐受性检测（斑点实验）

取适量处于对数生长期酵母BY4742细胞接种到5 ml的YPD液体培养基中，于30℃、以180 r/min在摇床中活化24 h，然后吸取400μl菌液，调整细胞密度为3×107个/ml，分别接种到含有邻苯二甲酸二辛酯浓度为0.0mg/L（对照）、1.0 mg/L、10.0 mg/L、100.0 mg/L的YPD培养基的96孔板中，将其置于30℃恒温振荡器中振荡培养，取1 ml细胞菌液，以12 000 r/min离心（离心半径为6.5 cm)3 min后，用PBS洗涤2～3次将YPD洗掉。并用PBS溶液将BY4742细胞的600 nm处吸光度值调整为2，用PBS溶液依次进行10倍梯度稀释。

将灭菌后的固体培养基分装在20 ml的塑料离心管中，分别加入40μl无水乙醇和1.0 mg/L、10.0 mg/L、100.0 mg/L DEHP，然后在操作台上进行倒板，倒板后等待培养基冷却后再将PBS稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5后的细胞菌液取5μl梯度菌液在固体培养基上依次点样（浓度由高到低），放置在30℃恒温培养箱中倒置培养48 h后，拍照并观察染毒酵母菌落生长情况。

1.5细胞凋亡实验

取邻苯二甲酸二辛酯浓度分别为0.00 mg/L（对照）、0.10 mg/L、0.25 mg/L、0.50 mg/L处理12 h的酵母1 ml菌液于Ep管中，以12 000 r/min离心（离心半径为6.5 cm)2 min后用PBS洗涤。加入细胞凋亡试剂盒中染色缓冲液1 ml重悬，再加入hoechst染色液、PI染色液各5μl后混匀，于4℃冰箱孵育20～30 min，取10μl菌液制片，在倒置显微镜下用蓝色荧光和红色荧光来检测细胞中期凋亡和晚期凋亡。通过观察不同浓度邻苯二甲酸二辛酯染毒酿酒酵母BY4742细胞中晚期凋亡数量关系图来阐明邻苯二甲酸二辛酯对酿酒酵母BY4742细胞的凋亡情况。记录并统计细胞中晚期凋亡总数以及细胞总数，进而计算出细胞中晚期凋亡率[细胞凋亡率=（凋亡总细胞数/总细胞数）×100%]。

1.6 细胞骨架染色及观察

通过预实验得出，邻苯二甲酸二辛酯在处理12 h的酵母细胞骨架染色效果较好，所以选取12 h作为处理时间点对细胞骨架进行染色。

取邻苯二甲酸二辛酯浓度为0.00 mg/L（对照）、0.10 mg/L、0.25 mg/L、0.50 mg/L处理12 h的酵母100μl，以3 000 r/min离心（离心半径为6.5 cm)1 min,PBS清洗2次，首先用多聚甲醛（约1 ml）固定30 min，离心弃上清，用PBS洗两次，每次需要于摇床上放置3min。再用PBST（含0.3%的Triton X-100）处理细胞10min，用PBS洗两次，每次放置3 min。然后加入10μl(5μg/ml）的鬼笔环肽暗环境下避光染色30～60 min，用1 ml的PBS清洗细胞2次。最后用DAPI（约1 ml）染色10～20 min避光吸去多余水分剩余100μl，制片，荧光显微镜下观察细胞骨架结构是否异常，记录并统计细胞核总数以及细胞核异常细胞数，最后计算出细胞核异常率[核异常率=（异常核总细胞数/总细胞数）×100%]。

1.7 实时定量（qRT-PCR）实验

取邻苯二甲酸二辛酯浓度分别为0.00 mg/L（对照）、0.10 mg/L、0.25 mg/L、0.50 mg/L处理12 h的酵母BY4742细胞5 ml，用PBS重悬然后进行离心，弃上清。每（1～5）×106个细胞加入500μl的RNA-easy，用移液器对菌液反复吹打，直至充分裂解。在裂解液中加入2/5体积的纯净水，上下颠倒混匀后静置15 min，然后进行离心取出离心管，此时溶液分成上层水相和深色的下层沉淀；将上层水相吸入到一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇上下颠倒混匀后室温静至10 min，然后在室温下离心10 min，量取适宜量的乙醇加入后轻弹管底，让沉淀悬浮起来并上下颠倒数次。重复加入乙醇和离心的步骤弃上清，室温放置晾干加入适量的水溶解沉淀，室温下旋涡3 min，让RNA沉淀充分溶解，提出的RNA产物可分装在-85℃至-65℃，长期保存也可在-30℃至-15℃可短暂保存。进行产物检测验纯度后，按使用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA（南京诺唯赞公司），使用TransScript Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR将RNA转化成cDNA（北京TransGen Biotech公司）。酵母BY4742细胞蛋白基因引物序列如下：

引物PDA1序列：

上游：5'-AGAAGAATGGAGATGGCTTG-3'

下游：5'-AGAACGGCTTTCACTGAGG-3'

引物LAS17序列：

上游：5'-TATTGATGTTACGGTGGCTC-3'

下游：5'-CCCAGATAACTCCTCTATGGC-3'

引物CRN1序列：

上游：5'-CAAAGTGACCAACAACGCA-3'

下游：5'-ATCGGTATCCAAGACCTGC-3'

引物Arc15序列：

上游：5'-AAGCCGATTGGAGGAGAA-3'

下游：5'-CCCAAAGAGTCACCACTTG-3'。

采用SYBR Green gPCR Master Mix染料（美国Med Chem Express公司）和LightCylerⓇ96 real-time PCR instrument（美国Roche Molecular Systems公司）。

反应体系为20μl，包括上、下游引物各1μl(10μmol/L）、10μl的SYBR Green I荧光染料、6μl的Nuclease-free水、2μl的cDNA.

反应程序：94℃活化30 s;94℃变性5 s,50～60℃退火15 s,72℃延伸10 s，共40～45个循环。

以PDA-1作为内参基因，采用2-ΔΔCt表示Arc15、Las17和Crn1基因的相对表达水平。其中，ΔΔCt=[（染毒组目的基因Ct值-染毒组内参基因Ct值）-（对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值）]。

1.8 统计学方法

重复以上实验3次，实验结果以表示。采用GraphPad Prism 8.4.0进行作图和统计分析。多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析（One-Way ANOVA）。进一步进行组间两两比较，若方差齐时，采用SNK检验（Student-Newman-Keuls）法；若方差不齐时，采用Games-Howell检验；率间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 邻苯二甲酸二辛酯染毒对酿酒酵母BY4742生长的影响

与对照组比较，除1.0 mg/L邻苯二甲酸二辛酯染毒组BY4742细胞的相对生长率略有升高（P>0.05）外；10.0 mg/L和100.0 mg/L邻苯二甲酸二辛酯染毒组BY4742细胞的相对生长率均较高，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。

表1 不同浓度邻苯二甲酸二辛酯染毒后酵母BY4742细胞的相对生长率

通过斑点实验得出，与对照组0.00 mg/L相比较，随着邻苯二甲酸二辛酯浓度增大，同一梯度下酵母菌落逐渐变稀疏，即生长受到抑制。表明不同浓度1.0mg/L、10.0 mg/L、100.0 mg/L邻苯二甲酸二辛酯均会抑制酵母细胞生长；且随着邻苯二甲酸二辛酯浓度的升高，酵母菌落生长情况变得愈加稀疏，即抑制生长效果愈明显。当邻苯二甲酸二辛酯浓度达到100.0 mg/L时，菌落变得更加稀疏，仅有少量酵母BY4742细胞生长。结果见图1。

图1 不同浓度邻苯二甲酸二辛酯染毒后酵母BY4742的生长情况

2.2 不同浓度邻苯二甲酸二辛酯对酿酒酵母BY4742细胞结构的影响

经0.00 mg/L、0.10 mg/L、0.25 mg/L、0.50 mg/L邻苯二甲酸二辛酯染毒12 h后，BY4742细胞的结构无明显变化，如图2所示。与对照组比较，加入邻苯二甲酸二辛酯后（浓度0.10 mg/L、0.25 mg/L、0.50 mg/L)BY4742细胞的细胞核结构、细胞形态、出芽生殖等无明显变化。

图2 邻苯二甲酸二辛酯染毒细胞结构图

2.3 邻苯二甲酸二辛酯染毒对BY4742细胞核的影响

经0.00 mg/L、0.10 mg/L、0.25 mg/L、0.50 mg/L邻苯二甲酸二辛酯染毒12 h后，BY4742细胞核呈现不同程度的异常，如表2和封三图3所示。细胞在未经邻苯二甲酸二辛酯染毒时（0.00 mg/L），细胞呈现出正常完整的胞核；与对照组相比较，经0.10 mg/L邻苯二甲酸二辛酯染毒组BY4742细胞的细胞核略微缩小，但无明显结构变化，细胞核异常率略有增加（P>0.05);0.25 mg/L邻苯二甲酸二辛酯染毒组BY4742细胞的细胞核缩小，细胞核异常率明显增加（P<0.05);0.50mg/L邻苯二甲酸二辛酯染毒组BY4742细胞的细胞核会呈现散点状，结构不完整，细胞核异常率明显增高（P<0.05）。随着邻苯二甲酸二辛酯染毒浓度的升高，BY4742细胞的细胞核出现了核碎裂，形成点块状大小不一的核碎片，核异常率呈上升趋势。

表2 邻苯二甲酸二辛酯对酿酒酵母BY4742细胞细胞核异常率的影响

2.4 邻苯二甲酸二辛酯对酿酒酵母BY4742菌株凋亡的影响

细胞凋亡是细胞对外界环境条件变化而发生的死亡过程，是一种细胞主动死亡现象，其发生主要是细胞处在一定病理或生理条件下，由特异信号有序激活细胞内在固有的死亡机制。通过观察细胞中期凋亡及晚期凋亡情况，探究在药物作用下是否会加快细胞凋亡情况。

经0.00 mg/L、0.10 mg/L、0.25 mg/L和0.50 mg/L邻苯二甲酸二辛酯染毒12 h后，细胞呈现不同程度凋亡。与对照组比较，0.10、0.25、0.50 mg/L邻苯二甲酸二辛酯染毒组BY4742细胞的早期、晚期凋亡细胞率明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；且随着邻苯二甲酸二辛酯染毒浓度的升高，酿酒酵母BY4742细胞的早期、晚期凋亡细胞率均呈上升趋势。如表3所示。

表3 邻苯二甲酸二辛酯对酿酒酵母BY4742细胞凋亡率的影响

2.5 染毒邻苯二甲酸二辛酯对BY4742细胞骨架的影响

经0.00 mg/L、0.10 mg/L、0.25 mg/L、0.50 mg/L邻苯甲酸二辛酯染毒12 h，细胞骨架呈现不同程度的异常，如封三图4所示。细胞在未经邻苯二甲酸二辛酯染毒时（0 mg/L），骨架的微丝和微管正常，可见绿色荧光染色后的斑点状，细胞骨架无明显异常；经0.10 mg/L、0.25 mg/L邻苯二甲酸二辛酯染毒后，BY4742细胞的骨架微丝变细，应力纤维减少。随着浓度增加，细胞骨架出现不同程度的荧光减弱，呈现明显的骨架斑块结构，细胞骨架异常率增加（P<0.05);0.50 mg/L邻苯二甲酸二辛酯染毒BY4742细胞后，细胞骨架结构不完整，发生变化且有明显斑块状，细胞骨架异常率增加尤为明显（P<0.05）。且随着邻苯二甲酸二辛酯染毒浓度的升高，BY4742细胞的骨架异常率呈上升趋势。如表4所示。

表4 邻苯二甲酸二辛酯对酿酒酵母BY4742细胞骨架异常率的影响

以0.50 mg/L邻苯二甲酸二辛酯作为蛋白基因实验浓度，进行qPCR实验，发现Arc15、Las17和Crn1基因均呈现不同程度的下调，酿酒酵母BY4742细胞骨架基因Arc15相对转录水平为53%;las17相对转录水平为68%,Crn1相对转录水平为35%，与对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。由此可见，Arc15、Las17和Crn1基因很有可能就是导致细胞骨架异常的相关基因。见表5。

表5 邻苯二甲酸二辛染毒酿酒酵母BY4742细胞骨架基因的相对转录水平

3、讨论

邻苯二甲酸二辛酯是一类可引起细胞损伤和凋亡的化合物，在对细胞作用过程中，可参与蛋白通道抑制神经毒性的作用[11-12]。已有大量研究表明，邻苯二甲酸二辛酯对细胞生长和周期等会造成不同程度的影响[13]。有研究发现，邻苯二甲酸二辛酯可对蟾胡鲇小鼠的肝脏存在毒性作用，进而导致肝脏组织出现病理学的变化[14]。由此可见，不同浓度邻苯二甲酸二辛酯对细胞功能的毒性作用是显而易见的，但对其机制的探讨研究还有待挖掘。

在本研究中，邻苯二甲酸二辛酯在低浓度下对BY4742细胞生长未造成明显影响，在高浓度下对BY4742细胞的生长抑制作用较为明显，表明邻苯二甲酸二辛酯是一类慢性毒性作用化合物。细胞骨架中存在的蛋白基因可通过相互作用参与骨架网络的形成[15]。本研究发现，邻苯二甲酸二辛酯虽有低浓度毒性，但在培养24 h后便会对细胞结构产生不同程度的影响。其中对于细胞骨架有很明显的影响，即导致细胞骨架出现微丝变细进而出现斑块状结构。在对邻苯二甲酸二辛酯的相关研究中也发现它可造成细胞组织DNA损伤[16]。本研究表明，邻苯二甲酸二辛酯对细胞核、细胞凋亡、细胞骨架具有不同程度的影响，进而推测出细胞在生长过程中核结构等会受到邻苯二甲酸二辛酯的影响。

因此，邻苯二甲酸二辛酯暴露高浓度下可以明显抑制细胞生长，这也验证了邻苯二甲酸二辛酯的急性毒性。本研究所采用的浓度在一定程度上对细胞的生长、骨架等所致的毒性效应明显，且邻苯二甲酸二辛酯暴露可能是导致了细胞骨架微丝变细破坏了细胞骨架而使得部分蛋白转录下调，也很有可能是减少了细胞骨架蛋白的合成作用，导致细胞骨架动态平衡受阻出现斑块结构。因此得出骨架结构的变化可能与Arc15、Las17和Crn1转录水平显著下调有关。

综上所述，邻苯二甲酸二辛酯在低浓度下对细胞生长无明显影响，但在高浓度情况下邻苯二甲酸二辛酯会对酿酒酵母BY4742细胞的生长存在明显的抑制作用，且抑制作用呈正相关。实验表明，邻苯二甲酸二辛酯染毒酵母BY4742细胞骨架相关基因Arc15、LAS17和CRN1转录水平在高浓度时会显著下调，邻苯二甲酸二辛酯暴露导致以上蛋白基因转录下调可能是细胞骨架出现斑块结构的主要原因。邻苯二甲酸二辛酯暴露对人类有很大程度的影响，尤其是会在人体内滞留对其造成慢性毒害作用。

图3 A（对照）、B(0.10 mg/L）、C(0.25 mg/L）、D(0.50 mg/L）分别为邻苯二甲酸二辛酯染毒酿酒酵母BY4742细胞细胞核的异常情况（DAPI染色，40×）；

图4 A（对照）、B(0.10 mg/L）、C(0.25 mg/L）、D(0.50 mg/L）分别为邻苯二甲酸二辛酯染毒酿酒酵母BY4742细胞骨架的异常情况（鬼笔环太染色，100×）

参考文献:

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基金资助:云南省教育厅科学研究基金(2023Y0614);云南省科技厅科技计划(202301AY070001-194);

文章来源:徐应丽,邹伟.邻苯二甲酸二辛酯对酿酒酵母BY4742细胞的毒性作用[J].环境与健康杂志,2024,41(11):954-959+1035.