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3例境外新冠病毒感染者的病毒全基因组测序分析

2023-08-23 173 上传者：管理员

摘要：了解境外新冠病毒全基因组特征和变异情况，及时发现境外流行新冠病毒变异类型，为云南省边境州市制定针对性的防控策略提供科学依据。方法 2021年11月，采集与云南省瑞丽市接壤的缅甸3例新冠病毒感染者的鼻咽拭子样本，提取核酸进行病毒全基因组测序，以新冠病毒武汉株Wuhan-Hu-1(NC＿045512)为参考序列进行比对分析。结果成功从3份样本中获得长度为29 881 bp、29 852 bp、29 875 bp的新冠病毒全基因组序列，基因组覆盖度为99.90%、99.87%、99.99%，分别检出39个、40个、45个碱基位点突变，涉及28个、26个、28个氨基酸变异，非同义突变占66.1%(82/124)，以ORF1ab基因占比最高，达37.8%(31/82)。序列比对显示3个境外感染者的病毒序列与云南同一时间监测的病毒基因组序列高度同源，系统发育树显示3个境外感染者和瑞丽本土疫情病例聚成一簇。结论 3个境外新冠病毒感染者的病毒均属Delta变异株（B.1.617.2进化分支），未监测到其他类型变异毒株。瑞丽市本土疫情的持续传播可能与边境人员和缅甸病例直接或者间接接触有关。

关键词：
全基因组测序
单股正链RNA病毒
新冠病毒
新冠肺炎
突变
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自2019年12月开始，新冠病毒（SARS-CoV-2）引起的新冠肺炎（novel coronavirus pneumonia,COVID-19）在全球范围内蔓延，严重威胁人类生命健康[1,2]。新冠病毒为单股正链RNA病毒，基因组全长约30 kb，包含5’非编码区（5’untranslated regions,5’UTR),3’UTR和12个蛋白编码区域。由于RNA病毒不稳定，病毒复制的自然突变率在10-4～10-6。突变导致蛋白质的氨基酸替换、丢失或者增加，影响蛋白质功能，部分突变不影响功能（同义突变），少量突变让病毒活下来并具备新特性。多个国家均发现新冠病毒存在氨基酸多位点突变的现象，可能引起传播能力增强[3]。为及时准确了解云南省瑞丽市流行的新冠病毒的基因组特征，追溯病毒潜在来源，追踪病毒变异变迁规律，云南省疾控中心于2021年7月将二代测序仪前移至瑞丽市开展测序工作，本研究选取了与瑞丽市接壤的缅甸某村寨3份新冠病毒感染者的呼吸道标本进行测序分析，现将结果分析如下。

1、材料与方法

1.1标本来源

2021年11月采集的与瑞丽市接壤的缅甸某村寨45人（45份）鼻咽拭子样本，瑞丽市疾控中心用实时荧光定量PCR法检出3份新冠病毒核酸阳性，编号为miandian1、miandian3和miandian4，于次日送至云南省疾控中心前移测序实验室进行新冠病毒全基因组测序。3份阳性样本均采集自无症状感染者。

1.2核酸提取与检测

将3份阳性样本用核酸提取试剂（西安天隆，磁珠法）提取核酸，用新冠病毒核酸检测试剂（实时荧光PCR法，上海伯杰）检测新冠病毒，具体操作参照《新型冠状病毒肺炎防控方案（第八版）》中《新冠病毒样本采集和检测技术指南》。样本信息及检测结果见表1。

表1本研究中样本信息及检测结果

1.3文库构建与全基因组测序

采用ULSEN超灵敏度新冠病毒全基因组捕获试剂盒（2021028XM）对提取的病毒RNA进行全基因组捕获扩增，用QI-Aquick PCR Purification试剂盒（Qiagen，德国）纯化扩增产物。按照Nextera XTDNA Library Preparation试剂盒（Illumina，美国）说明书构建DNA文库，用Illumina测序平台的Miniseq测序仪进行全基因组测序。

1.4全基因组序列分析

以NCBI中的新冠病毒毒株Wuhan-Hu-1 (NC＿045512）基因组作为参考序列，用CLC GenomicsWorkbench(Version22.0）软件对原始下机数据进行序列拼接。利用在线工具Nextclade (https：//clades.nextstrain.org/）和Pangolin(https：//pangolin.cog-uk.io/）对序列进行初步分型，然后使用线下的系统发育分析法进一步确认。从GISAID上筛选出同时期全球30条新冠病毒全基因组序列、武汉参考株和瑞丽市新增本土病例序列，用Mega7.0软件采用最大似然法（Maximum likelihood）构建系统发育树。Bootstrap值设置为1000，以评估可靠性。

2、结果

2.1基因组序列概况

3份样本经二代基因测序，基因组覆盖度分别为99.90%、99.87%和99.99%，平均测序深度为6 217×。见表2。

表2基因组测序结果

2.2核苷酸及氨基酸变异情况

2.2.1核苷酸变异分析

同武汉参考株（NC＿045512）序列相比，3个样本的全基因组序列共存在62个核苷酸突变位点，分别为miandian1有39个，miandian3有40个（其中非编码区1个），miandian4有45个。突变位点涵盖了新冠病毒的7个基因编码区（ORF1ab、S、ORF3a、M、ORF7a、ORF7b、N）及5’UTR和3’UTR，其中突变位数最多的是ORF1ab基因（29个），S基因13个。3个样本的基因组间共享28个突变位点，其中S基因共享8个突变位点。见图1。

图1核苷酸位点变异情况

2.2.2氨基酸突变分析

同武汉参考株（NC＿045512）序列相比，3个样本的全基因组序列共存在38个氨基酸突变位点，其中miandian1有28个，miandian3有26个，miandian4有28个。新冠病毒的6个编码区（ORF1ab、S、ORF3a、M、ORF7a、N）涵盖了3个样本的氨基酸突变位点，其中氨基酸突变位数最多的是ORF1ab(19个），其次是刺突蛋白S(10个）。3个样本间共享20个氨基酸突变位点，其中miandian1特有的氨基酸突变位点有4个，ORF1ab:R6017K、P6028L、L6319P,S:S221P;miandian3特有的氨基酸突变位点有2个，ORF1ab:T3586I、R6561T;miandian4特有的氨基酸突变位点有7个，ORF1ab:T1678A、S2500F、L3800F、M5531V、S5585I、P6609L,ORF3a:W128L。氨基酸突变情况见图2。

图2氨基酸位点变异情况

Delta变异株在变异初期S蛋白上共发生9个氨基酸突变和缺失（图3），其中受体结合区（receptor binding domain,RBD）的突变位点为L452R、T478K，其余为D614G、T19R、G142D、FR157-158del、P681R、D950N。进一步对3个样本S蛋白的氨基酸进行突变分析，S蛋白共存在10个氨基酸突变位点，3个样本共享8个氨基酸突变位点，其中T19R、A222V、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N等7个突变为Delta(B.1.617.2）变异株的特征性突变。G142D为3个样本共有的非特征性突变位点，S221P为miandian1特有的突变位点，H1101Y为miandian1和miandian3共有的突变位点。

图3 Delta变异株部分突变位点

2.3系统发育分析

系统发育分析表明，本研究的3个新冠病毒基因组序列与云南省的毒株聚成一簇，处于同一进化分支B.1.617.2上，与我国本土流行的新冠病毒毒株（武汉1-3月份流行株）属于不同的基因型，与同时期瑞丽市流行的病毒一致，属Delta变异株。见图4。

图4新冠病毒全基因组进化树

3、讨论

本研究获得3例境外无症状感染者的新冠病毒基因组序列，比对分析显示miandian1、miandian3、miandian4和毒株hCoV-19/Yunnan/1124/2021～hCoV-19/Yunnan/1129/2021的基因组序列高度同源，且系统发育分析支持3例境外感染者与瑞丽本土病例聚成一簇，证实瑞丽本土疫情的持续传播可能与境外病例直接或者间接接触有关。缅甸的新冠肺炎疫情形势复杂多变，缅甸籍人员在瑞丽市务工、边民互市、跨境通婚等方式的复杂性加剧了人员间的流通，同时缅甸战争和新冠肺炎疫情的双重压力将增加边境工作人员的职业暴露和感染风险。

B.1.617.2变异株（又称Delta变异株）最早于2020年10月在印度发现[4]，成为2021年全球主要流行变异株[5,6]。世界卫生组织对GISAID上的该突变株的序列进行初步分析发现，Delta变异株的增长速率明显高于印度流行的其他变异株[7]。Delta变异株包括38个基因型（AY.1、AY.2、AY.3、AY.3.1、AY.4、AY.5、AY.5.1、AY.5.2、AY.6、AY.7、AY.7.1、AY.7.2、B.1.617.2以及AY.8～AY.32)(https：//cov-lin eages.org/）。本研究的3个境外感染者Delta变异株基因组中有9个突变位点与S蛋白相关（T19R、156del、157del、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N），被认为是其成为最具传播性变异株的关键突变，在S蛋白上，受体结合区的突变被认为与病毒传染性、人与人之间的传播、免疫逃逸有关。

S蛋白是新冠病毒核衣壳表面的刺突蛋白，介导宿主细胞表面受体与病毒结合，是疫苗和治疗性抗体作用的关键靶点[8]。S蛋白由S1和S2两个亚基组成，可介导病毒识别宿主细胞受体，促进膜融合，并诱导免疫反应产生中和抗体[9],S1亚基上的受体结合域（RBD）能与靶细胞上的受体特异性结合，决定病毒对细胞的趋向性和致病性，因此，RBD被作为新冠病毒药物和疫苗研发的重要作用靶点。S2亚基上的融合肽（FP）可插入宿主细胞膜表面，在七肽重复序列1(HR1）和2(HR2）之间形成超螺旋结构，介导病毒蛋白发生构象改变，促使病毒与宿主细胞膜融合[10,11]。

本研究的3个感染者的S蛋白存在T478K和L452R两个位点的突变，弗林蛋白酶（Furin）裂解位点（氨基酸序列：PRRAR；氨基酸位点：681-685）上含有P681R和D614G的替换，和原始毒株相比，新出现在新冠病毒刺突蛋白的变异增加了病毒传染性，增加S1-S2裂解速率以及降低抗体介导的中和作用，并可能具有免疫逃逸能力[12]。L452R突变减少与RBD特异性单克隆抗体的中和活性[13,14]。B.1.617变异体主要影响刺突蛋白RBD的表面静电电位（electrostatic potential,EP）变化，EP的变化有可能利于病毒的传播，增强病毒的传染性[15]。由于病毒变异改变了刺突蛋白的结构，使病毒更容易与人体细胞表面的受体结合，更容易复制和传播，也更容易逃脱人体免疫系统的识别。有研究结果显示全球现有的第一代疫苗对Delta株的防感染保护力下降[16,17,18]，提示云南省边境州市接种新冠疫苗人群仍然有感染新冠病毒的风险。

S蛋白含有D614G突变位点，D614G突变是新冠病毒第614氨基酸位点D（天冬氨酸）突变为G（甘氨酸）。突变可以增强蛋白酶对S蛋白的切割能力，加速了S1亚基和S2亚基和形成，赋予了D614G突变株更强、更快感染宿主细胞的能力[19]。D614G突变可能是通过增加病毒表面功能完整S蛋白的数量，进而增加病毒与细胞结合的机会，增强了其感染效率，D614G突变的新冠病毒毒株传染性比原始毒株高近9倍[20]。D614G突变提高了病毒与人受体的结合能力，使得新冠病毒表现出更强的传染性和传播力，GISAID公开的全基因组序列统计表明，D614G突变成为全球最多的单一核苷酸突变位点[21]，研究证明D614G导致病毒感染能力增强，但D614G突变不会削弱抗体对病毒的中和能力[8,19],D614G突变还可能介导免疫逃逸，使个体容易第二次感染[22]。

P681R位点突变影响构成Furin裂解位点的残基，促进S蛋白的裂解，但对于病毒进入宿主细胞和细胞融合过程无显著影响[23]。D950N刺突蛋白突变未在其他变种中发现，它位于冠状病毒受体结合域之外，该区域有助于病毒与人类细胞融合，影响病毒感染的细胞类型，从而有可能伤害不同的器官和组织，也与更高的病毒载量有关。同时，研究还发现H1101Y、S221P突变，但其生物学特性还需进一步研究。本研究成功地从3例境外新冠病毒感染者标本中获得有效基因组序列，结果显示3份序列与瑞丽市境内流行株主要变异位点相一致，属于同一进化分支，提醒云南省强化边境地区巡逻管控，筑牢抵边查缉、二线拦截、辖区管控的“三道防线”，严防境外疫情输入。

新冠病毒依旧在全球肆虐传播，变异导致病毒的传播力、致病力依旧发生着改变[21,24]，对境外疫区流行的新冠病毒的变异特征和进化进行监测，追踪病毒变异变迁规律显得尤为关键，为边境州市疫情溯源和防控工作提供可靠的数据支撑，贯彻精准防控策略。

参考文献:

[1]张荣,易志刚,王玉燕,等.新型冠状病毒上海株(nCoV-SH01)的分离和鉴定[J].微生物与感染,2020,15(1):16-21

[3]朱苏,劳妙禅,高兴林新型冠状病毒突变株疫苗对突变株的作用[J].实用医学杂志,2022,38(7):783-785

[7]黄亚妮,王玲,曹梦西,等.新型冠状病毒(SARS-COV-2)的环境传播研究进展[J].环境化学,2021,40(7)

文章来源:刘照生,伏晓庆,张美玲等.3例境外新冠病毒感染者的病毒全基因组测序分析[J].中国国境卫生检疫杂志,2023,46(04):301-305+312