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紫草素调控白细胞介素-6治疗肺动脉高压的机制研究

2024-05-28 65 上传者：管理员

摘要：目的：探讨紫草素通过抑制白细胞介素（IL）-6及其下游信号通路逆转肺动脉高压（PAH）大鼠血流动力学和血管重构的机制。方法：24只SD大鼠随机数字表法分为对照组（CON组）、野百合碱肺动脉高压组（MCT-PAH组）、肺动脉高压紫草素干预组（MCT-PAH+SH组），每组8只。造模28 d后检测各组大鼠肺动脉血流动力学、右室肥厚指数，HE染色鉴定肺动脉形态学变化，Western blot和免疫组化检测IL-6、IL-21、CD163等分子的表达及定位。结果：与CON组相比，MCT-PAH组大鼠肺动脉血流加速时间（PAAT）缩短，心脏右室内径（RVID）增宽，三尖瓣瓣环收缩期位移（TAPSE）减低，右室肥厚指数增加，右室收缩压（RVSP）升高，肺动脉血管壁明显增厚，且以中膜肥厚显著。与MCT-PAH组相比，MCT-PAH+SH组大鼠PAAT延长，RVID略减少，TAPSE增加，右室肥厚指数改善，RVSP降低且肺血管肥厚程度改善。免疫荧光结果显示MCT-PAH组大鼠肺小动脉中IL-6的表达水平较CON组升高，MCT-PAH+SH组较MCT-PAH组下降。Western blot结果显示MCT-PAH组大鼠肺组织IL-6、IL-21表达水平较CON组增加，MCT-PAH+SH组较MCTPAH组下降。MCT-PAH组大鼠肺血管壁CD163表达水平较CON组明显升高，MCT-PAH+SH组较MCT-PAH组显著减低。结论：紫草素干预改善PAH大鼠右心血流动力学及肺血管重构，其机制可能与抑制IL-6及其下游分子IL-21、CD163相关。

关键词：
白细胞介素6
紫草素
肺动脉高压
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肺动脉高压（PAH）以肺血管生成异常导致血管进行性闭塞为特征，肺动脉压力、肺血管阻力进行性升高，其起病隐匿，进展迅速，最终可导致患者右心衰竭甚至死亡[1]。免疫与炎症机制在PAH发生、进展中的作用已得到广泛关注[2,3,4]，研究显示白细胞介素（IL)-6参与PAH的发生、进展，抑制IL-6及其信号通路可改善PAH血管重构[4,5]。紫草素为中药提取物，其主要成分为萘醌类[6]，研究发现在特发性关节炎动物模型中存在IL-6表达上调，紫草素可以通过抑制IL-6改善关节炎的病理改变[7]。本研究拟探讨PAH中IL-6及其下游信号分子表达的变化，和紫草素是否通过抑制IL-6表达以及其下游信号通路逆转PAH动物模型血流动力学改变和血管重构，以期拓宽紫草素的适应证。

1、材料与方法

1.1主要材料、试剂与仪器

SPF级健康雄性SD大鼠购自长沙市天勤生物技术有限公司[许可证号：SCXK（湘）2014-0011]，野百合碱购自Sigma-Aldrich公司，紫草素购自Selleck公司，IL-6、IL-21购自美国Aﬃnity公司，CD163购自中国Proteintech公司，β-actin购自美国Santa Cruz公司，α-SMA购自武汉Servicebio公司，Western Blot试剂盒购自北京Bio-Rad公司。

1.2动物实验

24只SD大鼠随机数字表法分为对照组（CON组）、野百合碱肺动脉高压组（MCT-PAH组）、肺动脉高压紫草素干预组（MCT-PAH+SH组），每组8只，体质量（190±15)g。MCT-PAH组及MCT-PAH+SH组以1%的野百合碱溶液腹腔注射造肺动脉高压动物模型（60 mg/kg)[8];MCT-PAH+SH组建模第21天起予腹腔注射紫草素10 mg/(kg·d)，连续7 d;CON组于建模第1天腹腔注射等量生理盐水。建模第21天CON组、MCT-PAH组腹腔注射等量紫草素溶剂，连续7 d。所有动物实验操作均获得湖南省儿童医院实验动物伦理委员会批准（批号：HCHLL-2020-44）。

1.3血流动力学检测

建模第28天使用超声心动图检测各组大鼠肺动脉血流加速时间（PAAT）、心脏右室内径（RVID）、三尖瓣瓣环收缩期位移（TAPSE）；超声检测完毕后使用心导管测量右室收缩压（RVSP）。

1.4右室肥厚指数测量及HE染色检测肺组织

测压结束后处死各组大鼠，解剖分离大鼠右心室（RV）与左室和室间隔（LV+S），称量并计算右室肥厚指数即RV/(LV+S)。大鼠肺组织石蜡包埋后切片，厚度为5μm，石蜡切片脱蜡，HE染色，中性树胶封片。显微镜下观察肺小动脉的形态学变化，包括血管厚度、肌化情况。

1.5 Western blot法检测蛋白表达

取大鼠肺组织样本，裂解后使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量；蛋白变性，制胶、上样、电泳、转膜、封闭，分别加入IL-6、IL-21、增殖细胞核抗原（PCNA）和细胞周期蛋白D(Cyclin-D）一抗，4℃孵育过夜，洗膜，加入相应二抗，再次洗膜，加ECL发光液，进行显影，化学发光系统摄片，使用Image J软件进行分析。

1.6免疫荧光检测IL-6的表达及分布

肺组织石蜡切片脱蜡、抗原修复，PBS洗涤；加IL-6、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）一抗；4℃过夜后放入PBS中洗涤，滴加荧光素标记的相应二抗覆盖组织，洗涤，先后加入荧光细胞核染料DAPI、自发荧光淬灭剂、抗荧光淬灭剂，封片。激光共聚焦显微镜下观察各蛋白在肺血管的荧光强度及分布。

1.7免疫组化检测CD163的表达

石蜡切片脱蜡，水化，抗原修复，PBS洗涤；避光孵育阻断内源性过氧化物酶后再次洗涤；室温封闭后滴加CD163一抗，4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，冲洗，加DAB显色液；显微镜下观察，阳性显色为棕黄色时自来水冲洗切片终止，苏木素复染后返蓝，封片，显微镜观察并进行图像采集。

1.8统计学分析

使用Graphpad prism 8.0软件进行统计学分析。所有数据均经正态性检验，符合正态分布的数据采用均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较通过LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 PAH大鼠模型建立及紫草素干预对大鼠血流动力学、血管重构的影响

实验过程中MCT-PAH组大鼠死亡2只，MCT-PAH+SH组死亡1只。超声心动图检测结果显示，与CON组相比，MCT-PAH组RVID增宽、PAAT缩短、TAPSE减低（P<0.01）；与MCT-PAH组相比，MCT-PAH+SH组PAAT延长（P<0.01),RVID略减低（P<0.05),TAPSE增加（P<0.05）。心导管测压结果显示MCT-PAH组RVSP明显高于CON组（P<0.001);MCT-PAH+SH组RVSP较MCT-PAH组有所减低（P<0.01）。见图1、表1。

图1实验组大鼠超声心动图检测结果

表1各组大鼠超声心电图及血流动力学指标比较

2.2紫草素对PAH大鼠肺组织病理改变的影响

MCT-PAH组右室肥厚指数较CON组明显增加（P<0.01),MCT-PAH+SH组较MCT-PAH组下降（P<0.05），见表1。HE染色结果显示CON组大鼠肺组织炎症细胞浸润少，肺血管较薄；MCT-PAH组大鼠肺组织比CON组炎症细胞浸润较多，中膜增厚[（403.53±14.18）µm对（105.52±1.65）µm,P<0.001]，管腔明显狭窄甚至闭塞；MCT-PAH+SH组肺动脉管腔较MCT-PAH组增大，血管壁厚度明显减低，特别是血管中膜厚度变薄[（235.64±1.65）µm对（403.53±14.18）µm,P<0.001]，见图2。

2.3 IL-6表达及分布

免疫荧光染色显示MCT-PAH组大鼠肺小动脉中IL-6荧光强度明显高于周边组织，MCT-PAH+SH组较MCT-PAH明显减弱，但与周边组织相比仍较强。与MCT-PAH组和MCT-PAH+SH组相比，CON组肺血管中IL-6荧光强度明显较低且与周边组织无明显差异，见图3。

2.4 IL-6、IL-21及增殖相关分子蛋白表达

Western blot结果显示MCT-PAH组肺组织中IL-6、IL-21表达水平较CON组增加，MCT-PAH+SH组IL-6、IL-21表达水平较MCT-PAH组减少；MCT-PAH组肺组织中增殖相关蛋白PCNA、Cyclin-D表达水平较CON组增加；MCT-PAH+SH组增殖相关蛋白PCNA、Cyclin-D表达水平较MCT-PAH组降低（图4、表2）。

图2大鼠肺动脉HE染色结果（×200)

图3 IL-6免疫荧光检测结果（×63)

图4 Western blot示IL-6、IL-21及增殖相关蛋白

2.5 CD163在肺血管的表达

CD163阳性表达位于细胞膜，少量表达于胞质和细胞外间质中。MCT-PAH组大鼠肺血管细胞膜上CD163表达较CON组明显增多，而MCT-PAH+SH组较MCT-PAH组表达减少，肺组织有少量CD163表达，见图5。

3、讨论

PAH是一种起病隐匿、进展迅速的致死性疾病，严重危害生命健康[9]。近年来研究表明PAH患者血管重构与炎症反应密切相关，多种炎症因子可引起PAH发生[10]。PAH患者血浆中炎症因子IL-6、IL-1水平明显升高[11]，且血浆炎症介质水平的升高与PAH患者预后不良相关。有研究指出IL-6、C反应蛋白等炎性因子是评价PAH患者病情严重程度的生物标志物[12]，炎症反应是判断PAH严重程度的新指标[13]，提示IL-6在PAH的发生、进展中发挥重要作用。

本研究发现MCT-PAH大鼠肺组织肺血管IL-6明显增加，提示IL-6可能为引起肺血管重构的主要炎症因子。既往研究发现低氧可促进IL-6表达水平升高，而低氧是PAH发病的主要触发因素[5]，表明IL-6可能在PAH的发病机制中发挥重要作用。本研究结果显示IL-6在MCT-PAH大鼠肺血管中表达明显增高，肺血管中IL-6表达水平较周边肺组织增加，表明PAH时肺组织存在炎症反应，而肺动脉血管壁的炎症反应最严重，进一步说明IL-6介导的炎症反应可能通过促进肺血管重构参与PAH发生。

表2各组大鼠IL-6、IL-21及增殖相关蛋白表达水平比较

图5肺血管中CD163表达的免疫组化结果

在PAH患者和实验动物模型中，存在多个IL-6相关的信号通路活化，现已明确STAT3是IL-6调控的主要转录因子[14],IL-6/IL-6受体复合物可能通过激活磷脂酰肌醇3–激酶（PI3K）/蛋白激酶B(Akt）和促分裂原活化的蛋白激酶（MARK）/胞外信号调节激酶（ERK）等信号通路导致PAH的发生[15,16]。同时研究显示IL-6可能通过上述信号通路之外的下游分子参与PAH的发生进展，其中炎症因子是目前研究的热点[17]。已有研究表明IL-6调节下游炎症因子表达参与PAH发生进展，包括IL-21和CD163[18]。

IL-21是由活化的CD4+T细胞产生的炎症因子，其与相应受体（IL-21R）结合后主要通过调节B细胞增生、促T细胞增殖分化、提高NK细胞杀伤活性等发挥免疫调节作用[17]。HashimotoKataoka等[18]发现在PAH发生机制中，IL-21是IL-6信号轴的下游靶点，其通过增强M2巨噬细胞极化促进缺氧诱导的PAH。本研究发现MCT-PAH组大鼠肺组织中IL-21较CON组表达明显增加，MCT-PAH+SH组IL-6及IL-21的表达均下降，提示IL-6可能通过促进IL-21表达参与PAH的发生，而紫草素可拮抗该通路的活化从而部分逆转肺血管重构。

CD163为M2型肿瘤相关巨噬细胞的生物标志物，其属于清道夫受体富半胱氨酸超家族成员，参与肿瘤局部炎症的调节[19]。研究证实PAH患者血清中CD163明显增高[20],CD163由抗炎信号如糖皮质激素和某些细胞因子（IL-6和IL-10）激活[21]，推测在PAH中IL-6可能通过信号通路促进CD163的表达及活化。本研究结果显示MCT-PAH组大鼠肺组织中CD163较CON组表达明显升高；MCT-PAH+SH组大鼠的CD163表达下降，提示CD163参与PAH的发生、进展，推测紫草素可能通过抑制IL-6及IL-21的表达和（或）活化降低CD163的表达，发挥抗PAH的作用。

研究显示紫草素具有调节免疫[22]、抑制病毒、抗炎[23]等多种生物学作用，其抗炎作用的机制可能为调节IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α）、一氧化氮（NO）等的表达或活性[24]。已有研究显示，紫草素干预可降低低氧PAH模型小鼠的肺动脉压。本研究发现紫草素对PAH大鼠的血流动力学有改善作用。HE染色发现MCT-PAH+SH组肺动脉血管中膜较MCT-PAH组变薄，免疫荧光结果提示紫草素可减低IL-6的表达，与CON组相比，MCT-PAH组肺组织中增殖相关蛋白表达均增加，而紫草素可以降低上述增殖蛋白的表达水平；免疫组化结果显示MCT-PAH+SH组大鼠CD163表达较MCT-PAH组减少，以上结果提示紫草素可部分逆转MCT-PAH大鼠肺血管重构，其机制可能是抑制IL-6、IL-21、CD163炎症信号通路。本研究有望阐明IL-6参与PAH发生的分子机制，为拓展紫草素的适应证提供理论基础。

参考文献:

[7]代巧妹,王金凤,张凤山.紫草素对晚期胶原性关节炎的作用研究[J].哈尔滨医科大学学报, 2009, 43(1):48-51.

基金资助:国家自然科学基金(81500041);湖南省卫生健康委课题(20200849);

文章来源:王勋,左婉云,肖政辉,等.紫草素调控白细胞介素-6治疗肺动脉高压的机制研究[J].国际心血管病杂志,2024,51(03):175-180.