前言

根据目前国际糖尿病组织在网站公布的数据来看，随着经济的发展，人们生活方式的改变和人口老龄化的趋势造成了糖尿病患者发病率逐年增高，截止至2019年，全球约4.63亿成人罹患糖尿病，约一半患者没有得到诊断，而根据统计预算全球的糖尿病患者数量在2045年将可能达到7亿，并且其发病呈年轻化趋势，引起人们广泛关注[1]。从IDF公布数据可以发现如今中国已然成为糖尿病大国，全国范围内约有1.21亿糖尿病患者，有八千万以上的患者年龄小于65岁，不仅给患者带来生活质量上的困扰，同时也给其家庭带来了沉重的经济负担。

与此同时医学研究的发展对于糖尿病引起的眼病、心血管疾病、肾病和外周神经病变有了更加深入的了解，而除了通常人们所熟知的心血管、肾脏等系统的损伤之外，人们对糖尿病患者生殖系统损伤的关注也逐年增多，不仅仅在生殖器官组织结构与生殖细胞的增殖及其功能变化方面，对生殖激素合成与分泌紊乱、性功能障碍及生殖能力等问题的关注也愈加密切。睾酮主要是由睾丸分泌，据流行病学统计，糖尿病将影响患者精子质量和生育能力，超过90%的男性糖尿病患者都伴随有低睾酮血症而导致患者生精能力降低和性器官及第二性征生长受限并导致糖尿病性勃起功能障碍[2]，而糖尿病患者发生性功能和生殖功能障碍的概率是非糖尿病患者的5-10倍[3,4]，对患者身心造成严重影响。糖尿病所致的生殖功能障碍大多是因糖尿病所致睾丸组织损伤而产生，但由于确切的分子机制不明，暂时并无特效药物治疗。

目前临床上具有多种药物用于治疗糖尿病，二甲双胍是一种有效地降血糖药物，可以通过减少肠道中糖的吸收、增强葡萄糖的细胞内转运和抑制肝脏中糖原的产生来有效地控制血糖。在其60多年的临床应用中，Met不仅被用于控制糖尿病患者的血糖水平，而且还被用于预防糖尿病并发症，对糖尿病心肌病[5]和糖尿病视网膜病变[6]据有显著疗效。虽然Met对糖尿病引起的其他并发症有一定的作用，但对于睾丸功能障碍的治疗及其机制尚未见报道。

Prokineticin2（PK2）是前动力蛋白的表型之一，最早由MollayC等从蟾蜍的皮肤分泌物中发现了一种分子量为8kDa的蛋白质并命名为Bv8[7]，随后在一些哺乳类动物（鼠、猴、人等）体内都发现了Bv8的同源蛋白，分别命名为前动力蛋白1(Prokineticin1,PK1)和前动力蛋白2。PK是一种小分子信号肽，自被发现以来逐渐成为研究的热门，许多科研工作者都着手尝试解析PK及前动力蛋白受体在人体内的作用及其作用机制，以期通过PK及PKR来调控疾病发生发展。研究发现，PK及PKR在中枢系统中持续诱导新的中间神经元从脑室下区延伸至嗅球，以此调节嗅球的生长发育，同时PK与离散脑区的发育、机体痛觉过敏和动物摄食行为等具有密切联系，甚至可以起到保护受脑缺血影响神经元的作用[8,9]；在心血管系统中可以促进心脏细胞的增殖和存活，改善病变后的心脏功能和预后[10]；同时PK对血管的再生也有一定的调控作用，PKR在不同的内皮细胞中有着不同的表达，可以促进STAT3活性和STAT3下游血管生成与促增殖/存活基因的表达，进而调控肿瘤细胞的生长[11]；同时机体发生病理改变后PK能干涉机体的炎症反应与应激反应，在炎性粒细胞和巨噬细胞中表达增加，刺激单核细胞的迁移，引发炎性疼痛并且驱动外周致敏，进而调控局部炎症反应[11-13]。有研究表明PK2在调节促性腺激素释放激素（GnRH）促进性腺发育方面发挥作用，PK2基因被敲除后将导致小鼠GnRH神经元数量急剧减少并伴有嗅觉缺失，同时睾丸发育延迟和变形，进而出现精子发生缺陷，基本丧失生育能力[14-16]；当GnRH缺乏症患者使用性激素替代治疗后正常成年个体临床症状得到一定程度的缓解，但仍有少数PK2结构突变的患者依然保持着少精子/无精子的症状无法缓解[17]；当实验者将小鼠的PKR1和PKR2基因分别敲除后，发现PKR2基因敲除的小鼠不仅生殖器官的重量有所降低，更为显著的是睾丸的生精管萎缩，管腔狭小，间质稀疏且间质细胞较少，虽然生精细胞未明显减少但小管腔内未见精子[18]。越来越多的证据表明PK2及其受体PKR在生殖功能中发挥着不可替代的作用，然而其具体机制仍不明朗，亟需进一步阐明其作用方式。

本研究试图通过评价PK2/PKRs通路在糖尿病睾丸损伤中的作用以及Met对糖尿病引起的睾丸损伤、生殖功能障碍、凋亡、自噬和PK2/PKRs通路的影响来阐述糖尿病引起的睾丸生殖功能障碍的作用方式，为临床治疗提供新的理论依据。本研究分为两个部分：

第一部分：通过腹腔注射链脲佐菌素建立小鼠糖尿病模型，在糖尿病确诊后的适当时间点（2个月（2M）、3个月（3M）、4个月（4M）和5个月（5M））对小鼠进行麻醉后处死，采集附睾以统计小鼠生殖功能并迅速取出睾丸，部分睾丸保存在Bouin’s固定液中进行组织形态学检查。其他样品存放在-80℃冰箱以待进行其他实验。

第二部分：STZi.p.建立小鼠糖尿病模型并在确诊后给予Met治疗四个月，对小鼠进行麻醉后处死，采集附睾以确定小鼠生殖功能并迅速取出睾丸，部分睾丸保存在Bouin’s固定液中进行组织形态学检查；利用荧光生物素标记观察血睾屏障完整性；进一步通过免疫组化和RT-qPCR、Westernblot等检测小鼠睾丸PK2、PKR1、PKR2、Bax、Bcl-2、及Akt/GSK3β信号通路蛋白表达情况来研究Met对糖尿病小鼠睾丸损伤的保护作用。

第一部分 PK2/PKRs在糖尿病小鼠睾丸损伤中的作用

1.实验材料

2.实验方法

2.1STZ诱导糖尿病小鼠模型

适应性喂养一周后，将小鼠随机分为2组：正常对照组（Control，n=60）和糖尿病组（DM，n=100）。连续5天给DM组小鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ，50mg·kg-1·d-1，0.1mol/L柠檬酸缓冲液，pH4.5）[19]，同时对照组小鼠注射等量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。在STZ注射后7天内监测小鼠随机血糖，血糖水平≥16.7mmol/L的实验动物被诊断为糖尿病，随后每周监测血糖[19]。

2.2观察指标及检测方法

2.2.1血糖检测

每周小鼠禁食12h后通过尾静脉取血，用血糖仪检测血糖水平。

2.2.2组织样本收集

在糖尿病诊断后的适当时间点（2M、3M、4M和5M），对小鼠进行麻醉后处死，摘取睾丸进行称重并计算睾丸与体重的比值，即睾丸脏器系数。取部分睾丸组织保存于Bouin’s固定液中用于组织形态学检测，其余部分置于液氮中快速冷冻后置于-80℃超低温冰箱中以待后续实验使用。

2.2.3生殖功能测定

取小鼠附睾尾部置于1mL37℃无菌生理盐水中剪碎混匀制成精子悬液，取部分悬液滴在清洁载玻片上并计数5个视野中的可活动精子和非活动精子的数量，计算精子活力（精子活力=活动精子数/总精子数×100%）。用移液枪吸取0.02mL精子悬液置于0.38mL37℃生理盐水中，混匀后滴入细胞计数板上并计算五个中心方格中精子的数量，用平均数乘以109，即可得到每升精液的精子数。

2.2.4组织形态学检查

（1）组织包埋切片从Bouin’s固定液中取出固定24h的睾丸组织，经流水冲洗干净后使用自动组织包埋机包埋，将包埋后的蜡块置于切片机上切取4μm厚度组织，在恒温水浴锅中固定于载玻片上然后烘干备用。（2）HE染色依次将切片置于二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%乙醇5min-75%乙醇-蒸馏水中脱蜡，使用Harris苏木精染3~7min后水洗1min，再使用1％盐酸酒精处理5~8s，水洗1min，0.6％稀氨水返蓝40s，自来水冲洗1min，最后在伊红溶液中浸染1~3min后将切片依次放入乙醇（95％~100％）及二甲苯中脱水封片。

2.2.5蛋白质免疫印迹

（1）组织蛋白提取称取适量睾丸组织，精准称重后按1:10（1mg:10μl）比例加入现配裂解液，于冰上在组织研磨器中反复多次研磨裂解30min后将裂解液转至1.5mL离心管，放入4℃预冷离心机中12000rpm离心15min，离心后取上清液装于离心管备用。

（2）蛋白浓度测定及变性使用碧云天BCA蛋白试剂盒测定组织蛋白浓度。将标准蛋白和组织蛋白稀释到合适浓度后依次加入96孔板中，BCA工作液按照50:1比例配制，每孔200μLBCA工作液，两~三个复孔，混匀1min后于37℃孵育30min，酶标仪562nm波长测定吸光度，通过吸光度-浓度曲线计算出样本蛋白浓度。吸取含有50-70μg组织蛋白的上清液加入适量裂解液和5×BUFFER，充分混匀后于95℃加热5min，放入﹣20℃保存。

（3）分离胶和浓缩胶的配制用蒸馏水洗净玻璃板后，水平对齐，紧密卡入胶架。根据目的蛋白分子量大小制作10~12％分离胶，按照前述方法制作分离胶，混匀后迅速灌入洁净的玻璃板内，胶面滴加95％乙醇压平胶面，静置至分离胶完全凝固后弃掉乙醇并沥干。根据配方制作5％浓缩胶，混匀后迅速加入分离胶上，将配套梳子插入浓缩胶中，待胶凝固备用。

（4）电泳每块胶两边加样孔中加入适量蛋白上样maker，取10~20μL蛋白样品缓慢加至加样孔中，60V电压电泳45min后调整为90V电压，待溴酚蓝到胶底部时停止电泳。

（5）转膜取出凝胶，将裁剪好的PVDF膜浸泡在甲醇中2min后放入﹣4℃预冷的转膜液，依据目的蛋白分子量大小设定电流大小和时间后用湿转方法将凝胶上蛋白转至PVDF膜上。待转膜时间完毕，将PVDF膜取出放入TBST中。

（6）封闭将膜用TBST洗3次，每次10min，放入含5％脱脂奶粉的TBST封闭液中，摇床室温封闭2h。

（7）孵育一抗封闭完成后用TBST洗3次，每次10min，用一抗稀释液依据抗体效价稀释抗体：PKR1（1:500）、PKR2（1:500）、PK2（1：1000）、p-GSK3β（1:1000）、GSK3β（1:1000）、p-Akt（1:1000）、Akt（1:1000）、GAPDH（1:10000）。将膜浸泡于稀释后的抗体中4℃摇晃孵育过夜。

（8）孵育二抗孵育一抗过后，TBST洗3次，每次10min，将膜放入对应的二抗，室温下孵育1h后用TBST洗3次，每次10min。

（9）显影ECL显影液按A：B=1：1均匀混合，将膜放入显影液中，均匀覆盖静置2min，避光置于凝胶成像仪，选择合适曝光时间，得出印迹并用软件分析灰度值。

2.3统计学分析

所有数据用x±SEM表示，用SPSS17.0软件进行分析，通过One-WayANOVA进行检验，P<0.05表示有显著差异性。

3.结果

3.1糖尿病对小鼠代谢及生殖能力影响

糖尿病小鼠随着实验进程逐渐出现毛发粗糙杂乱、暗淡无光泽等现象，同时出现饮食饮水增多、体重减轻而尿量增多等典型糖尿病表现。与对照组相比，DM小鼠从确诊糖尿病后2M开始体重和睾丸质量显著减轻而脏器系数增加（P<0.05），长期维持高血糖状态（P<0.05），结果见表1。在生殖功能方面，虽然糖尿病早期小鼠睾丸中的总精子数与对照组小鼠睾丸中的总精子数相比显著降低（P<0.05），但精子仍保持着活性（P>0.05）。随着疾病的发展，糖尿病小鼠的生殖能力逐渐下降，精子活力和精子总数也持续下降（P<0.05）。

3.2糖尿病破坏小鼠正常睾丸生理结构

小鼠睾丸的生理结构变化如图1所示。在对照组中生精上皮的各级生精细胞排列有序，多数为6-7层，曲细精管管腔内可见大量精子生成。然而糖尿病小鼠睾丸生精小管出现明显的萎缩和损伤，生精上皮细胞层数明显减少，大多数仅有3-4层甚至更少，管腔中可见大量脱落的生精细胞，精子发生显著减少。随着疾病的发展，组织损害逐渐恶化，在5M时糖尿病小鼠睾丸生精小管形态被完全破坏，正常生殖功能基本丧失。

3.3PK2/PKRs在糖尿病小鼠睾丸组织中的表达

在以往的报道中，PK2/PKR2被发现是小鼠睾丸组织正常生理功能的重要调节蛋白。因此，我们推测PK2/PKRs信号通路影响糖尿病小鼠睾丸生殖功能。如图2所示，与对照组相比糖尿病小鼠PK2和PKR2的表达持续下调（P<0.05），而PKR1水平在2个月和3个月时下调（P<0.05），在4个月和5个月时上调（P<0.05）。Akt/GSK3β是PK2/PKRs的下游蛋白，在我们的研究中，当PK2/PKR2蛋白表达受到抑制时，Akt/GSK3β的表达也处在较低水平。

3.4Akt/GSK3β在糖尿病小鼠睾丸组织中的表达

众所周知，Akt/GSK3β通路与糖原合成、细胞生长和存活有关。为了进一步阐明糖尿病所致睾丸损伤的潜在机制，我们拟确定Akt/GSK3β信号通路对睾丸损伤的影响。如图3所示，在DM组小鼠睾丸组织中发现与对照组比较Akt和GSK3β磷酸化显著减少（P<0.05）。

4.讨论

糖尿病是一组胰岛素分泌绝对或相对不足而导致的糖代谢紊乱疾病，在物质相对充裕的现代社会，糖尿病的发病率一直稳步上升，全球糖尿病患者的逐年增多给世界各国医疗行业带了极大地负担，经统计学预算在2045年糖尿病医疗支出预计超过14520亿美金[1]。糖尿病患者长期高血糖状态将导致机体多个脏器的损伤，最常见的并发症是糖尿病心肌病、肾病和视网膜病变，然而越来越多的证据表明糖尿病可导致生殖功能损害，其发病率是非糖尿病病人的5～10倍，给患者的身心和健康带来了严重的困扰[3,4,20]。因此，探究糖尿病生殖损伤的病理机制并寻找积极有效地防治糖尿病生殖病变的方式及药物迫在眉睫。

睾丸是雄性生殖器官的重要组成部分，睾丸生精细胞具有精子生成的功能，维持其正常的组织结构和生理功能是保障两性生殖的前提，而血管分布密集的睾丸组织受到了高血糖的影响将破坏其基本结构与功能。在糖尿病早期形成过程中，虽然组织结构尚未改变，但机体长期处于高糖状态，一方面降低线粒体DNA含量、睾丸线粒体复合体Ⅲ和腺苷酸能荷，刺激机体产生氧化应激反应（OS），产生大量的活性氧（ROS）并降低了机体的抗氧化能力，促进细胞凋亡，损害睾丸产生精子的质量及其功能，同时附睾组织的OS标记物有所增加[21]，表明在精子的储存与活化过程中也受到ROS的影响；另一方面机体在高血脂和高血糖的作用下通过芳香化酶促进雌激素超量分泌，而雌激素通过负反馈调节机制抑制下丘脑分泌促性腺激素释放激素（GnRH），从而导致男性患者性腺机能减退，性腺激素结合球蛋白（SHBG）以及睾酮水平下降[22]，若疾病发生在幼儿发育早期可表现为生殖器发育不全和假两性畸形，成年男性患者除了表现阳痿、不育之外，同时还可能出现乳腺增生等症状[23]。糖尿病患者经早期疾病发生过程中高糖状态对机体代谢产生影响，未能良好的控制血糖，病情的不断发展使得一些组织和器官逐渐发生形态结构改变和功能障碍[24]，睾丸生精小管出现明显的萎缩和损伤，生精上皮细胞层数明显减少，大多数仅有3-4层甚至更少，管腔中可见大量脱落的生精细胞，精子发生显著减少，且随着疾病的发展，组织损害逐渐恶化，后期糖尿病小鼠睾丸生精小管形态被完全破坏，正常生殖功能基本丧失[25,26]。

本研究第一部分探讨了糖尿病对睾丸组织的损伤作用，我们采用了C57BL/6J小鼠通过小剂量多次STZ诱导建立糖尿病模型，相比其他方式该方法更为安全稳定，成模率和小鼠存活率更高。与对照组相比我们可观察到糖尿病小鼠睾丸组织随着时间的推移不仅生殖功能逐步降低，同时组织结构也渐渐破坏，到5M时已完全丧失基本结构。这个结果证实了糖尿病引起睾丸组织结构的病理改变并展示了糖尿病睾丸损伤的动态过程，为后续研究奠定了基础。

PK最早作为一种具有促进肠道收缩作用的小分子蛋白质而被熟知[27]，随着研究的进展越来越多的证据表明PK在血管生成的过程中发挥关键调控作用[27]，而血管生成对黄体、胎盘和睾丸等器官的正常发育和功能具有重要的影响，因此许多研究者着手研究PK在生殖器官中的潜在作用。编码PK的基因在生殖系统中高度表达已被证实，主要是集中分布在哺乳动物的睾丸、卵巢、胎盘与子宫等器官中[28]。PK1和PK2在不同组织中的表达量有所不同，但都发挥了特定的生理作用，调控机体生殖器官的生长发育及发挥正常的生理功能[29,30]。同时PKR作为PK的受体因其选择性不同而在各种生殖器官中的表达量存在差异[31]。

在雄性生殖器官中，PK2基因出现高度表达，尤其是在雄性的睾丸中能稳定检测到PK2蛋白，并发现其主要是在初级精母细胞中表达，而在其他细胞中的表达几乎可以忽略不计[32]。当研究者将小鼠的PK2基因敲除后，小鼠出现类似于人类Kallmann综合征的表现，即下丘脑促性腺激素释放激素神经元数量急剧减少同时伴有嗅觉缺失或减退的低促性腺激素型性腺功能减退的症状，在生殖方面表现为青春期性发育不佳和生育能力受损，基本上丧失了生育能力[33]。观察组织结构发现PK2基因被敲除的雄鼠表现出生精小管不仅较正常小鼠的生精小管更为纤细，同时部分小管管腔缺乏，单倍体精母细胞和精子细胞缺如，而雌性小鼠则出现因卵泡发育不全、缺乏成熟卵泡和黄体而导致的发情周期中断和生育能力丧失[16]。在一项研究中，研究者发现对GnRH缺乏症患者使用性激素替代治疗后成年个体的临床病症得到了一定程度的缓解，但仍有少数PK2结构突变的患者依然保持着少精子/无精子的症状无法缓解[34]，提示PK2在调节原发性睾丸功能和精子发生中的重要作用，因此PK2也可以作为检测生殖功能的途径之一。而当睾丸出现炎症反应时，睾丸中PK2及其受体PKR1的表达量出现了明显的变化，有趣的是在此研究中急性炎症反应和慢性炎症反应所出现的变化呈现不同的趋势[35]，由此我们可以推测出PK2及其受体在不同的疾病中通过不同的信号通路发挥特定的作用，进而对维护机体组织的完整性及其正常的生物功能作出重要的贡献。

我们通过检测不同时期PK2及PKRs在糖尿病小鼠睾丸组织中的表达变化发现，与正常对照组相比糖尿病小鼠PK2和PKR2的表达持续下调，PKR1水平在2个月和3个月时下调而在4个月和5个月时出现了上调，表明PK2及PKRs受糖尿病影响而表达受抑制，同时糖尿病睾丸病变可引起睾丸炎症改变并伴有血管生成促使PKR1大量表达，导致4、5个月糖尿病小鼠睾丸组织PKR1的表达增多。因此我们认为PK2/PKRs是糖尿病睾丸损伤的关键因素，恢复PK2/PKRs的表达可成为治疗糖尿病睾丸损伤的新靶点。

与其他G蛋白偶联受体家族一样，通过研究PKR的结构发现PKR上有两个结合位点：7TransMembrane(TM)-bundle结合位点和氨基末端细胞外表面结合位点，通过此双位点结构PK与PKR特异性结合[36]。PK和PKR结合后受到局部效应和/或内分泌激素的调节，在不同的系统中与不同的G蛋白（例如GI、GQ和GS蛋白）偶联，激活磷脂酶C并形成第二信使IP3诱导细胞内钙离子的动员，刺激磷酸肌醇的周转，进而激活丝裂原活化蛋白激酶或磷酸肌醇3-激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、蛋白激酶C等信号传导通路，从而参与机体摄食、代谢、昼夜节律、血管生成、造血、炎症及炎症性疼痛、免疫反应和生殖等活动[37]。

最近相关实验表明PK2基因初级转录本有两个可选的剪接变异体PK2和PK2L，它们被切割成一个活性肽（即PK2β），若激活PKR1受体将优先偶联GQ和GS蛋白，然后以此发挥生物学效应，值得注意的是由PK2β激活的PKR1将不能与GI蛋白偶联；但PK2β与PKR2结合，那么其结合体将优先选择GS蛋白，其次是GQ蛋白和GI蛋白，有着明显的偏好选择顺序[11]。PK在生殖系统中具体通过何种生物信号通路的研究暂时只有零星报道，有学者认为PK1/PKR1信号通过GQ/11-ERK激活子宫内膜中活化T细胞通路的钙调磷酸酶/核因子，从而调节基因转录[38]；而PK2/PKR1信号可降低睾丸炎症反应时IL-4和IL-10的生成，从而损害炎症过程中的抗炎免疫反应，有助于白细胞的浸润及免疫细胞中细胞因子的产生，减轻睾丸炎症损伤[39]。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞存活、生长、增殖、凋亡、血管生成、血管舒张和细胞代谢中发挥重要作用[40]。Akt能使Caspase-9磷酸化，抑制其活性，同时能磷酸化BAD从而促进Bcl-2释放，抑制细胞凋亡[41]。

Akt参与胰岛素相关信号转导，在胰岛素信号传导过程中，胰岛素受体酪氨酸磷酸化后，胰岛素受体底物家族成员蛋白被磷酸化，激活PI3K通路，磷酸化Akt，导致GSK3β失活[42]。GSK3β是Akt下游底物之一，活化的Akt能与GSK3β结合，诱导GSK3β向细胞膜转位，使其磷酸化而失活，磷酸化的GSK3β能促进炎症因子产生，加重组织损伤[42]。在体外培养睾丸组织细胞时发现，Akt信号通路是支持细胞和生精细胞中调节功能的特定锚定连接，高表达的磷酸化Akt与睾丸损伤密切相关[43]。

在本研究中我们通过检测Akt/GSK3β信号通路蛋白，其磷酸化表达在糖尿病小鼠睾丸组织中明显减弱，说明糖尿病可通过PK2/PKRs/Akt/GSK3β信号通路造成小鼠睾丸组织结构破坏与生殖能力损伤，为探究糖尿病生殖损伤的病理机制提供了一定的理论依据，为后续治疗糖尿病生殖损伤提供了靶点选择。

5.结论

（1）糖尿病可引起小鼠睾丸组织破坏与生殖功能损伤；（2）糖尿病小鼠睾丸组织PK2/PKRs表达下调；（3）糖尿病小鼠睾丸组织Akt/GSK3β信号通路受抑制。

第二部分 PK2/PKRs在二甲双胍保护STZ诱导糖尿病小鼠睾丸损伤中的作用

1.实验材料

2.实验方法

2.1STZ诱导糖尿病小鼠模型后给予二甲双胍治疗

适应性喂养一周后，将小鼠随机分为3组：正常对照组（Control，n=20）、糖尿病组（DM，n=25）和二甲双胍治疗组（DM+Met，n=25）。连续5天给DM和DM+Met组小鼠腹腔注射STZ（50mg·kg-1·d-1，0.1mol/L柠檬酸缓冲液，pH4.5），同时对照组小鼠注射等量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。在STZ注射后7天内监测小鼠随机血糖，血糖水平≥16.7mmol/L的实验动物被诊断为糖尿病，随后每周监测血糖。在STZ成功诱导糖尿病模型后将DM+Met组小鼠饮水更换为盐酸二甲双胍水溶液（250mg·kg-1·d-1），持续给药4M。

2.2生物素示踪

（1）小鼠麻醉后依次切开皮肤筋膜以暴露睾丸组织，使用超微注射针在睾丸白膜下注射50μLbiotintracer工作液后将睾丸置于原位并缝合皮肤。（2）半小时后处死小鼠并取出睾丸浸泡于固定液中过夜，经石蜡包埋后进行组织切片并脱蜡水化。（3）将切片浸泡于含5%脱脂奶粉和0.01%TritonX-100的PBS封闭液15min，再使用含有15%血清和1%BSA的PBS修复液中进行抗原修复30min。（4）抗原修复后滴加荧光工作液于组织上并在暗盒中孵育120min，使用PBST清洗3次/5min，滴加DAPI后封片并于荧光显微镜下观察。

2.3免疫组化

（1）石蜡切片脱蜡至水。（2）切片于EDTA抗原修复液中微波8min至沸，停火保温8min转中低火7min，自然冷却后PBS洗3次，每次5min。（3）切片于3％过氧化氢溶液中室温避光孵育30min，PBS中洗3次，每次5min。（4）用3％BSA覆盖组织，室温封闭30min，弃掉封闭液后用PBS按比例配好的一抗覆盖组织，置于湿盒内4℃孵育过夜，PBS洗3次，每次5min。（5）切片稍干后滴加对应二抗孵育1h，PBS洗3次，每次5min。（6）切片稍干后滴加现配的DAB显色液，置于显微镜下观察，切片显棕黄色时用自来水冲洗控制显色。（7）Harris苏木素复染3min后，自来水洗1min，1％盐酸酒精分化5~8s，自来水洗1min，返蓝，流水冲洗。（8）切片依次放入乙醇（75％~100％）及二甲苯，晾干，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

2.4睾丸细胞凋亡检测（TUNEL）

（1）将切片放入二甲苯Ⅰ15min，二甲苯Ⅱ15min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，85%酒精5min，75%酒精5min，蒸馏水洗。（2）切片稍干后，蛋白酶K工作液（10μg/mL）覆盖组织37℃孵育30min后PBS洗3次，每次5min。（3）破膜工作液覆盖组织，室温孵育20min后PBS洗3次，每次5min。（4）TdT和dUTP混合液覆盖组织于湿盒内37℃孵育2h后PBS洗3次，每次5min。（5）切片使用10%血清封闭30min后用甲醇配制的10％过氧化氢溶液避光孵育15min后PBS洗3次，每次5min。（6）POD覆盖组织于湿盒内37℃孵育30min，PBS洗3次，每次5min。（7）在切片上滴加DAPI染液避光室温孵育10min。（8）切片依次放入乙醇（75％~100％）及二甲苯Ⅰ脱水透明后，晾干，中性树胶封片。

2.5透射电镜观察睾丸超微结构

（1）取新鲜小鼠睾丸组织约1mm×1mm×1mm大小，电镜固定液4℃过夜，0.1M磷酸缓冲液（PhosphateBuffer，PB）漂洗3次，每次15min。（2）1%的锇酸·0.1M的PB（pH7.4）室温固定2h，0.1M的PB（pH7.4）漂洗3次，每次15min。（3）将睾丸组织依次放入由低至高即50％→70％→80％→90％→95％→100％酒精→100％丙酮中脱水，每次15min。（4）将组织放入丙酮：812包埋剂=1:1中3~4h，丙酮：812包埋剂=1:2过夜，纯812包埋剂6~7h，样品放入装有812包埋剂的包埋板中37℃烤箱12h。（5）60℃烤箱聚合48h。（6）用切片机切取60~80nm薄的切片。（7）2%醋酸铀饱和酒精溶液，枸橼酸铅，各染色15min，切片室温干燥过夜。（8）通过透射电子显微镜观察睾丸超微结构。

2.6实时逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）

TRIzol试剂用于提取睾丸组织的总RNA，并通过以下PCR程序将每个样品中的RNA反转录为cDNA：95℃持续10分钟，然后于95℃持续15s，60℃持续60s并以此进行40个循环。反应后完成后，将反应产物通过琼脂糖凝胶电泳，并对结果进行ΔΔCT方法分析。引物序列见表2。余方法同第一部分

3.结果

3.1Met改善糖尿病小鼠的一般状态及生殖能力

为了提高糖尿病小鼠的生活质量和生殖能力，我们对糖尿病小鼠使用Met治疗四个月。经Met治疗后，糖尿病小鼠的头发逐渐恢复光泽，小鼠体重增加，血糖水平也得到很好的控制（表3）。此外，糖尿病小鼠的精子活力和精子数量在治疗后显著增加，这增强了它们的生殖潜能（表3）。与DM小鼠相比，用Met处理的小鼠具有更好的繁殖潜能，两组之间有显著性差异（P<0.05）。

3.2Met改善糖尿病小鼠睾丸组织的组织形态学损伤

同样，在用Met处理的小鼠中，睾丸中曲细精管的形态与对照组相似。在Met治疗组中，生精上皮的损害明显减轻，生精细胞层数明显增加，细胞排列整齐，观察到精子生成（图4c）。在生物素示踪研究中，可观察到对照组EZ-linkSulfo-NHS-LC-Biotin分布在生精小管外，但在糖尿病小鼠中，生物素越过Sertoli细胞间隙进入到生精小管，而Met能够修复血液-睾丸屏障并防止这种损害（图4b）。

透射电镜表明，对照组中生精细胞在睾丸组织的各个水平上都有序排列（图4dⅰ）。在DM组中，生精细胞排列紊乱，并且在细胞质中出现液泡变性或崩解，细胞核中核仁不清晰，线粒体水肿，大量染色质聚集以及胞间桥广泛分解（图4dⅱ）。但是，Met处理使线粒体的变化正常化，仅表现出轻微的水肿，并且染色质仍然积累（图4dⅲ）。

3.3Met预防糖尿病引起的睾丸凋亡

TUNEL测定试剂盒用于检测TUNEL阳性细胞的数量。与对照小鼠相比，DM小鼠的凋亡细胞数量增加。与未治疗的糖尿病小鼠相比，Met治疗可显著抑制糖尿病小鼠的睾丸细胞凋亡（图5a）。众所周知，Bax和Bcl-2是细胞凋亡的调节标志物。增殖细胞核抗原（PCNA）是DNA聚合酶复合物的滑动夹具，除了在DNA修复和DNA甲基化中起作用外，PCNA还涉及细胞凋亡。如图5所示，在DM组的睾丸中，Bcl-2和PCNA的表达降低，但是Bax的表达增加。在糖尿病小鼠中，Met处理显著降低了Bax/Bcl-2的比率并增加了PCNA表达（图5）。

3.4Met激活糖尿病小鼠睾丸细胞的自噬

为了评估自噬在糖尿病睾丸损伤中的作用，我们选择了自噬相关蛋白Beclin-1，P62和轻链3B（LC3B）来观察Met治疗后糖尿病小鼠自噬水平的变化。数据表明，Met有效激活了小鼠睾丸组织中的自噬（图6）。

3.5Met激活小鼠睾丸中的PK2/PKR2途径

在第一部分实验中，我们证明了PK2/PKR在糖尿病睾丸损伤期间发生的一系列变化中起着重要作用。为了评估Met的重要性，我们通过RT-qPCR，免疫组织化学和Western印迹分析了睾丸组织中PK2/PKRs的水平变化。与对照组相比，糖尿病小鼠睾丸组织中PK2和PKR2的水平明显降低，而PKR1的水平则升高。Met治疗显著逆转了这些变化（图7）。

3.6Met激活Akt/GSK3β信号通路

Akt是PK2/PKRs途径的关键下游靶点，哺乳动物中的雷帕霉素受体是在Akt介导下自噬的关键调节剂。糖尿病显著降低了睾丸中Akt和GSK3β的磷酸化，这一变化被Met所逆转（图8）。

4.讨论

Met最早是从欧洲一种名为法国紫丁香的植物中提取出的胍类物质，由于其毒性较大早期未使用于临床，而后期合成的胍类衍生物降低了其生物毒性从而成为临床用药，是目前临床治疗糖尿病的有效药物，主要通过激活腺苷酸蛋白激酶和非AMPK途径降低血糖。盐酸二甲双胍更是被国际糖尿病联盟、美国糖尿病联合会和欧洲糖尿病研究学会确定为治疗糖尿病的一线药物[44]，临床应用已有60余年，由于其降糖的有效性与安全性而受到患者的青睐。二甲双胍除了具有降糖、抗炎、抗氧化、抗衰老[45]、降低血压血脂[46,47]、抗肿瘤[48]等作用外，越来越多的证据表明Met可用以治疗糖尿病并发症[49,50]。有研究发现Met可能通过AMPK通路抑制肝糖原异生增强胰岛素敏感性、调解脂质代谢、抑制炎症因子生成等机制保护糖尿病心血管系统，并且Met能抑制心肌细胞凋亡，使血管重构，降低心肌氧化应激水平，抑制细胞凋亡，同时抑制心肌线粒体损伤，起到保护糖尿病心肌的作用[51]。另有研究报道Met通过激活PI3K/Akt信号通路增加Akt磷酸化，发挥神经保护作用，抑制凋亡、氧化应激和神经炎症，改善脓毒症引起的脑损伤[52]。在大鼠肝脏中，二甲双胍通过加强IRβ、IRS2和Akt的磷酸化，激活NASH和肝硬化的胰岛素抵抗大鼠肝脏PI3K/Akt信号，增加肝糖原储存，改善胰岛素抵抗[53]。NaickerN等[54]发现胡芦巴籽提取物与二甲双胍都能增加IR-3β、Akt、GSK-3β的磷酸化，增强胰岛素信号、基因表达和增加葡萄糖摄取来发挥抗高血糖作用。Met被广泛用于糖尿病及其并发症的治疗当中，而Met对糖尿病引起的生殖功能损伤是否具有保护作用暂未见报道，亟需进一步研究。

本研究通过小剂量多次腹腔注射STZ诱导C57BL/6J小鼠构建糖尿病模型，并在模型成功后给予治疗组小鼠Met水溶液（250mg·kg-1·d-1）替换饮水。根据本研究第一部分结果，为避免因年龄过大导致睾丸组织功能降低，我们在给予Met水溶液4M后观察小鼠各项生理指标及其病理变化。

睾丸支持细胞是位于生精小管管壁基膜侧并延伸入管腔中的细胞，为各个时期的生精细胞提供结构性支持、营养支持和保护作用，并与相邻的支持细胞共同形成血睾屏障，为精子生成提供有利条件[55]。多项研究报道糖尿病可能是通过破坏支持细胞结构和血睾屏障的完整性从而导致睾丸生殖功能损伤[56,57]，修复血睾屏障成为挽救生精功能的有效方式。本研究发现荧光生物素可进入糖尿病小鼠睾丸生精小管管腔之中，证实了血睾屏障被破坏，而给予Met治疗的糖尿病小鼠可以恢复血睾屏障的完整性，生精细胞层数得到了修复，精子生成增多且精力活力恢复，基本改善了糖尿病小鼠的组织结构和生殖功能。同时我们通过免疫组化、PCR和Westernblot观察睾丸组织中PK2/PKRs/Akt/GSK3β信号通路的RNA及蛋白表达变化，表明Met可以上调PK2/PKRs系统从而保护小鼠睾丸组织。

自噬是真核细胞中的自我清除过程，正常的自噬可以帮助维持生物体内细胞生长的平衡，尤其是防止高血糖和低氧引起的睾丸损伤[58]。然而，异常自噬与许多疾病的发病机制有关。自噬不足或过度自噬会导致生殖细胞变性。同时，它可以降解线粒体和内质网等细胞器，破坏睾丸的稳定性，影响其生长发育以及正常的生理功能[59]。高血糖会影响雷帕霉素复合物1（mTORC1）的哺乳动物靶点并通过氧化导致自噬相关基因4（ATG4）失活，最终导致自噬相关基因8（ATG8）脂化并形成自噬体在细胞中诱导自噬[60]。自噬相关蛋白Beclin-1，轻链3B（LC3B）和泛素结合蛋白（P62/SQSTM1）是生物组织中自噬激活的标志物。Beclin-1和LC3B参与自噬小体的形成和延长，而P62作为一种支架蛋白，结合泛素化的底物并通过自噬帮助其聚集和降解[61]。我们注意到糖尿病小鼠中的自噬受到抑制，Beclin-1表达降低，LC3II与LC3I的比例降低以及P62表达增加，这与以前的报道相对应[62,63]。此外，我们还发现，Met治疗可诱导睾丸组织自噬水平增强。

由凋亡诱导基因Bax和凋亡抑制基因Bcl-2共同调控的凋亡被认为是糖尿病诱导睾丸损伤的可能机制的主要因素[64]。Bax/Bcl-2之间的不平衡会激活下游的caspase信号传导途径，诱导细胞凋亡，最终导致精子发生功能障碍[65]。有证据表明自噬与凋亡通路之间存在联系。自噬可以去除多余的细胞成分以抑制凋亡，而凋亡相关蛋白caspase的激活则阻碍了自噬体的形成[66]。我们的研究表明，糖尿病小鼠睾丸组织的凋亡与Bax升高，Bcl-2和PCNA降低相关，当用Met治疗糖尿病小鼠时，睾丸损伤过程中涉及的细胞凋亡得到有效抑制。因此，我们的研究支持PK2/PKRs信号转导级联在改变Met引起的自噬反应和抑制糖尿病睾丸损伤过程中凋亡方面的可能作用。

5.结论

（1）Met改善糖尿病小鼠的组织结构和生殖能力

（2）Met激活糖尿病小鼠睾丸组织PK2/PKRs/Akt/GSK3β通路

（3）Met调节糖尿病小鼠睾丸组织自噬活性和细胞凋亡过程

总结

我们的研究结果表明，糖尿病将引起小鼠睾丸组织结构破坏并损伤其生殖功能，PK2/PKRs途径在糖尿病睾丸损伤中起着不可替代的作用。Met通过调节睾丸中的PK2/PKRs并恢复Akt/GSK3β信号通路的磷酸化来调节自噬活性和细胞凋亡进而保护STZ诱导的睾丸损伤。尽管糖尿病引起的睾丸生殖功能损伤的临床处理仍然具有挑战性，但我们的研究为糖尿病睾丸生殖损伤的治疗和预防和提供了新的思路，值得进一步的临床研究。

综述：《Prokineticin及其受体在生殖系统中作用研究进展》

摘要：前动力蛋白是从蛙类和蛇毒中提取出来的一对有着极高相似度的调节肽，早期作为一种具有促进肠道收缩作用的小分子蛋白质而被熟知。近年来，越来越多的研究发现PK及其受体在睾丸、前列腺、子宫、卵巢、胎盘组织中均有表达并参与维持其正常的生理功能。本文回顾了近年来国内外相关报道，对PK及其受体在生殖系统中发挥的作用进行综述，为临床诊治生殖系统疾病提供新的思路。

关键词：生殖系统；Prokineticin；Prokineticin受体；生殖健康；作用机制；研究进展

1999年MollayC等从蟾蜍的皮肤分泌物中发现了一种分子量为8kDa的蛋白质并命名为Bv8[1]。对其结构分析发现Bv8是前动力蛋白的一种表型，随后在一些哺乳类动物（鼠、猴、人等）体内都发现了Bv8的同源蛋白，分别命名为前动力蛋白1(Prokineticin1,PK1)和前动力蛋白2。PK是一种小分子信号肽，自被发现以来逐渐成为研究的热门，许多科研工作者都着手尝试解析PK及前动力蛋白受体在人体内的作用及其作用机制，以期通过PK及PKR来调控疾病发生发展。研究发现，PK及PKR在中枢系统中持续诱导新的中间神经元从脑室下区延伸至嗅球，以此调节嗅球的生长发育，同时PK与离散脑区的发育、机体痛觉过敏和动物摄食行为等具有密切联系，甚至可以起到保护受脑缺血影响神经元的作用[2,3]；在心血管系统中可以促进心脏细胞的增殖和存活，改善病变后的心脏功能和预后[4]；同时PK对血管的再生也有一定的调控作用，PKR在不同的内皮细胞中有着不同的表达，可以促进STAT3活性和STAT3下游血管生成与促增殖/存活基因的表达，进而调控肿瘤细胞的生长[5]；同时机体发生病理改变后PK能干涉机体的炎症反应与应激反应，在炎性粒细胞和巨噬细胞中表达增加，刺激单核细胞的迁移，引发炎性疼痛并且驱动外周致敏，进而调控局部炎症反应[5-7]。

而近年来越来越多的研究表明PK及其受体（PKR）在卵巢、子宫、胎盘、睾丸的生理功能中扮演着重要角色[8]。本文就PK及其受体在生殖系统的研究展开综述。

1、PK的生理结构

PK1和PK2的编码基因位于人类1号染色体短臂和3号染色体短臂上，仅有45％的氨基酸序列相同，但在序列末端有着相同的六肽序列氨基酸，此序列可影响PK的生物活性。PK1又称内分泌腺源性血管内皮生长因子，其编码基因位于染色体1P21.1上，由三个外显子组成，迄今为止，还没有关于替代剪接所产生的产品的报告。相反，位于染色体3P13.3上的PK2基因有四个外显子，由两个蛋白质交替剪接而产生。PK编码基因经翻译后形成了两种大约含有80个残基的分泌蛋白，两种蛋白间除了具有五个相同的二硫键母基外，保守的N-末端延伸和C-末端结构域也十分相似，经过诱变和蛋白酶消化实验证明这些结构对PK的生物活性具有关键意义[9]。

2、PK在生殖系统的作用

由于血管生成对雌性黄体和胎盘的正常发育和功能具有重要的影响，而PK又在血管生成的过程中发挥了关键作用，因此许多研究者着手研究PK在生殖器官中的潜在作用。编码PK的基因在生殖系统中高度表达已被证实，主要是集中分布在哺乳动物的睾丸、卵巢、胎盘与子宫等器官中[8]。PK1和PK2在不同组织中的表达量有所不同，但都发挥了特定的生理作用，调控机体生殖器官的生长发育及发挥正常的生理功能。同时PKR作为PK的受体因其选择性不同而在各种生殖器官中的表达量存在差异，因PK和PKR有多种结合方式，其不同的组合方式将会产生特异的功能性质。

2.1PK1在生殖系统中的作用

PK1也被称为曼巴肠毒素1或EG-VEGF，早期研究发现其结构与血管内皮生长因子家族不同，但在特定的细胞与组织内却有着与VEGF相似的生物学活性。随着研究的深入，PK1的结构与功能越发清晰，不但确定其归属于分泌蛋白家族，同时也逐步发现PK1在机体诸多系统中皆有所作用。

PK1在男性生殖系统中主要存在于睾丸中，由睾丸间质细胞合成。PK1通过与VEGF-a的结合进而诱导睾丸内皮细胞的增殖、存活与迁移而参与睾丸的血管生成及维持内皮细胞的完整性[10]。在前列腺中PK1也有部分表达，主要是由腺上皮合成，发挥了同样的作用。虽然PK1参与调控睾丸及前列腺血管生成的调节，但在蛋白水平上PK1的表达仅仅在增生和发生癌变的组织中才能大量检测到，这也提示我们睾丸肿瘤与前列腺肿瘤的发展与PK1密切相关[11]。

PK1在女性生殖器官中主要分布于卵巢之中，雌激素、孕酮、人绒毛膜促性腺激素以及低氧诱导均可刺激PK1的合成，同时PK1的分泌水平会随着卵巢周期的变化而波动，与VEGF相比PK1的表达要强数倍，同样具有促进血管生成的作用，同时在子宫内膜容受性、胚胎着床和胎盘形成中具有明显的作用，这些作用在后续研究中发现与多囊卵巢综合征和卵巢过度刺激综合征等卵巢疾病发生有关。一旦女性受孕进入妊娠早期时，PK1受到HCG的刺激在胎盘中开始大量表达，血中蛋白浓度最高峰时可达到非孕妇的5倍。PK1在妊娠的前三个月中可以控制绒毛外滋养细胞的迁移和假血管网络的形成而稳定妊娠的发展。随着时间的推延，到了妊娠中期PK1表达逐渐下降，但仍然高于非孕妇的蛋白水平，同时集中的分泌部位转变为合体滋养层。后续研究发现在妊娠晚期阶段反复注射PK1不仅不会引起宫缩，反而可以稳定子宫防止流产的发生，而反复妊娠丢失（recurrentpregnancylose,RPL）的女性体内PK1及其受体PKR1、PKR2的多态性和正常女性相比有显著性差异[12]，由此可知PK1及其受体在女性生殖功能上有着不可或缺的作用，可作为评价RPL风险的新型生物标志物，另可通过改变机体PK1的含量可有效保护女性生殖安全用以稳定正常妊娠，探索PK1/PKR的调控机制有望减少PCOS、OHSS及RPL等疾病的发生。

2.2PK2在生殖系统中的作用

一直以来在人们的认知中，PK2更多是作为促进肠道收缩的蛋白而存在的，随后发现PK2在生殖系统也有所作用，不仅参与哺乳动物的生殖器官的生长发育，同时对维持动物正常的繁殖生育能力具有重要的调控作用。与PK1在雌性生殖器官大量表达不同，PK2在雌性生殖器官中几乎无法检测到，但最近的研究表明，PK2可能通过下丘脑前阿片皮质激素途径弧形投射到视前内侧核的阿片-促黑素细胞皮质素原神经元上刺激女性产生性冲动从而参与了雌性动物生殖行为的调节[2]。

而在雄性生殖器官中，PK2基因出现高度表达，尤其是在雄性的睾丸中能稳定检测到PK2蛋白，并发现其主要是在初级精母细胞中表达，而在其他细胞中的表达几乎可以忽略不计。当研究者将小鼠的PK2基因敲除后，小鼠出现类似于人类Kallmann综合征的表现，即下丘脑促性腺激素释放激素神经元数量急剧减少同时伴有嗅觉缺失或减退的低促性腺激素型性腺功能减退的症状，在生殖方面表现为青春期性发育不佳和生育能力受损，基本上丧失了生育能力[13]。观察组织结构发现PK2基因被敲除的雄鼠表现出生精小管不仅较正常小鼠的生精小管更为纤细，同时部分小管管腔缺乏，单倍体精母细胞和精子细胞缺如，而雌性小鼠则出现因卵泡发育不全、缺乏成熟卵泡和黄体而导致的发情周期中断和生育能力丧失[14]。在一项研究中，研究者发现对GnRH缺乏症患者使用性激素替代治疗后成年个体的临床病症得到了一定程度的缓解，但仍有少数PK2结构突变的患者依然保持着少精子/无精子的症状无法缓解[15]，提示PK2在调节原发性睾丸功能和精子发生中的重要作用，因此PK2也可以作为检测GnRH缺乏症病因的途径之一。而当睾丸出现炎症反应时，睾丸中PK2及其受体PKR的表达量出现了明显的变化，有趣的是在此研究中急性炎症反应和慢性炎症反应所出现的变化呈现不同的趋势[16]，由此我们可以推测出PK2及其受体在不同的疾病中通过不同的信号通路发挥特定的作用，进而对维护机体组织的完整性及其正常的生物功能作出重要的贡献。但现阶段研究尚不充足，亟需更多的实验来研究PK2及其受体在生殖系统中的具体功能及机制。

2.3PKR在生殖系统中的作用

PK能激活两种内源性G蛋白偶联受体（PKR1和PKR2），两种受体有着高达85%以上的序列同源性，这种高度受体序列保守性提示我们PK在生物学过程中具有关键功能并以此受体通路发挥其生物学效应。虽然二者高度相似，但PKR1的信号转导效率要高于PKR2，这是因为PKR1中存在较强的正电荷氨基酸Arg，而PKR2中只有弱正电荷氨基酸Lys和中性氨基酸Asp，导致其在细胞第二内环中正电荷净量的不同而产生转导速率差异[17]。经受体转染的哺乳动物细胞系分析发现，在生殖系统中PK2与PK1相比对PKR具有较高的亲和力[18]，表明PK2是PK/PKR系统在生理条件下的较强的激动剂，发挥更强的生理学效应。另有研究表明PKR2在大脑（嗅球、脑室下区等）、甲状腺、肾上腺及睾丸等内分泌组织中大量表达，而PKR1则主要表达于外周组织，比如心脏、前列腺、胃肠和脾脏等[19]。但在女性生殖系统中，PKR1和PKR2在卵巢和胎盘中都存在表达且发挥着不可或缺的作用。

当实验者将小鼠的PKR1和PKR2基因分别敲除后，发现PKR2基因敲除的小鼠不仅生殖器官的重量有所降低，更为显著的是睾丸的生精管萎缩，管腔狭小，间质稀疏且间质细胞较少，虽然生精细胞未明显减少但小管腔内未见精子；而雌性小鼠卵巢以未发育卵泡为主，只有少量卵泡呈腔状但不完整，同时未见黄体生成。而在激素水平上，小鼠的促性腺激素释放激素、睾酮和卵泡刺激素均明显低于对照组小鼠。相对的，PKR1基因敲除的小鼠的生殖系统并未发现显著性差异[20]。由此可知在生殖系统中PK是通过与PKR2结合来发挥其生殖功能调控作用的。

3、PK在生殖系统中发挥作用的生物信号通路

与其他G蛋白偶联受体家族一样，通过研究PKR的结构发现PKR上有两个结合位点：7TransMembrane(TM)-bundle结合位点和氨基末端细胞外表面结合位点，通过此双位点结构PK与PKR特异性结合。PK和PKR结合后受到局部效应和/或内分泌激素的调节，在不同的系统中与不同的G蛋白（例如GI、GQ和GS蛋白）偶联，激活磷脂酶C并形成第二信使IP3诱导细胞内钙离子的动员，刺激磷酸肌醇的周转，进而激活丝裂原活化蛋白激酶或磷酸肌醇3-激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、蛋白激酶C等信号传导通路[21]。

最近相关实验表明PK2基因初级转录本有两个可选的剪接变异体PK2和PK2L，它们被切割成一个活性肽（即PK2β），若激活PKR1受体将优先偶联GQ和GS蛋白，然后以此发挥生物学效应，值得注意的是由PK2β激活的PKR1将不能与GI蛋白偶联；但PK2β与PKR2结合，那么其结合体将优先选择GS蛋白，其次是GQ蛋白和GI蛋白，有着明显的偏好选择顺序[22]。PK在生殖系统中具体通过何种生物信号通路的研究暂时只有零星报道，有学者认为PK1/PKR1信号通过GQ/11-ERK激活子宫内膜中活化T细胞通路的钙调磷酸酶/核因子，从而调节基因转录[23]；而PK2/PKR1信号可降低睾丸炎症反应时IL-4和IL-10的生成，从而损害炎症过程中的抗炎免疫反应，有助于白细胞的浸润及免疫细胞中细胞因子的产生，减轻睾丸炎症损伤[24]。PK激活不同的PKR将产生多种偶联组合，那么这种信号多样性在机体各种系统中发挥的生理作用不尽相同，通过特定的组合方式可针对性调节机体功能，从而达到预防及治疗效果。

4、展望

PK是一个新的蛋白质家族，通过控制中枢激素分泌和外周器官发育等方式，不仅在维持生物正常生殖功能上发挥着无可替代的作用，同时越来越多的证据表明在病理状态下PK对机体的保护和修复有着不可或缺的作用。VEGF抑制剂已被批准用于临床治疗多种恶性肿瘤和多种新生血管疾病，可以有效改善患者预后及减轻其他治疗药物产生的不良反应[25]。PK和VEGF有着类似结构，PK在生殖系统的多种疾病中也是通过促进血管再生等方式造成病理改变。因此，将VEGF抑制剂和PK拮抗剂联合应用在部分疾病治疗中可能具有不错的前景。然而就目前研究水平来看，虽然已明确发现PK及其受体PKR在生殖系统病理状态下发挥了特定的作用，但在大多数疾病中其发挥作用的机制尚不明晰，且多数研究都是以啮齿动物作为模型，缺乏灵长类动物研究的资料，并且在啮齿动物不同的疾病模型中PK发挥着不同的效应，其具体机制仍需我们继续深入研究。但可以肯定的是PK可作为一些疾病的早期标志物以供早期诊断，探究PK及其受体PKR在生殖系统病变中的相关性及作用机制有望为我们诊治生殖系统病变提供新的诊疗思路。

参考文献：

[4]黄聪,郭敏,陈娟,等.前动力蛋白2在心血管病变中的研究进展[J].中国药理学通报,2018,34(07):892-894.

刘宇宁.PK2/PKRs在二甲双胍保护糖尿病睾丸损伤中的作用[D].湖北科技学院,2020.

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