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醋炙柴胡对抑郁症小鼠治疗的增效减毒作用研究

2024-11-26 84 上传者：管理员

摘要：目的探讨醋炙柴胡对抑郁症小鼠治疗的增效减毒作用。方法 70只雄性C57小鼠随机分为对照组、模型组、帕罗西汀组(10 mg/kg)、生柴胡低剂量组(1.5 g/kg)、生柴胡高剂量组(12 g/kg)、醋炙柴胡低剂量组(1.5 g/kg)、醋炙柴胡高剂量组(12 g/kg),每组10只。除对照组外，其他组小鼠均采用慢性不可预知温和应激法构建抑郁模型，再相应给药处理15 d,对照组、模型组以等体积生理盐水替代。通过糖水消耗实验、旷场实验及强迫游泳实验评价小鼠抑郁样行为，检测各组小鼠肝功能，HE染色观察肝组织病理变化，酶联免疫吸附试验检测肝组织中脂质过氧化物含量。结果与对照组比较，模型组糖水偏好率、进入旷场中心区域时间降低，游泳不动时间延长，血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆汁酸(TBA)及肝组织丙二醛、4-羟壬烯醛和白三烯B4含量升高(P<0.05)。与模型组比较，生柴胡低剂量组、醋炙柴胡低和高剂量组、帕罗西汀组糖水偏好率升高，生柴胡低和高剂量组、醋炙柴胡低和高剂量组、帕罗西汀组进入旷场中心区域时间延长，游泳不动时间缩短，ALT、AST、TBA、4-羟壬烯醛和白三烯B4明显降低，醋炙柴胡低和高剂量组、帕罗西汀组丙二醛降低(P<0.05),以醋炙柴胡低剂量组效果最佳。生、醋炙柴胡组肝组织病理变化改善。结论醋炙柴胡对抑郁症小鼠的增效减毒作用优于生柴胡。

关键词：
丙二醛
丙氨酸转氨酶
抑郁症
柴胡
醋炙
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抑郁症是心境障碍的主要类型，多表现为显著而持久的心境低落，严重者可出现躯体症状，并出现自杀企图或行为[1]。该病的发病机制和病理生理学复杂，尚未有针对性药物，可持久稳定的改善患者抑郁症状[2]。因此，还需要研发新型抗抑郁药物。近年来研究发现，应激导致的抑郁还与肝脏疾病相关，会影响肝功能[3]。中医关于抑郁的情志致病说与现代应激理论相符，认为肝具有疏泄情志的功能，抑郁症的治疗也多以肝为切入点[4]。临床统计显示，柴胡是常用的抗抑郁中药，具有疏肝解郁、透表泄热的作用[5]。既往研究表明，柴胡不同炮制品的抗抑郁效果不同[6]。药性五味中酸味入肝，将柴胡醋炙后可增强药效入肝[7]。但醋炙柴胡具体的作用机制仍有待深入分析。因此，本研究采用慢性不可预知温和应激法构建小鼠抑郁模型，拟分析醋炙柴胡抗小鼠抑郁模型的增效减毒作用。

1、材料与方法

1.1 实验动物

雄性C57小鼠70只，4～6周，体质量20～24 g, 购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司[SCXK(苏)2018-0008],动物操作符合实验动物护理原则，饲养环境：每12小时交替昼夜，温度23～25 ℃,湿度50%～60%。本研究经江西中医药大学实验动物伦理委员会审核批准(20230313038)。

1.2 药品、试剂与仪器

柴胡购自湖北省北方柴胡种植基地，鉴定为北柴胡的干燥根；帕罗西汀纯度≥99%,货号：B34589-20 mg, 购自上海源叶生物公司。天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和总胆汁酸(total bile acid, TBA)检测试剂盒货号分别为C010-1-1、C009-3-1、E003-1-1,购自南京建成生物工程研究所；丙二醛酶联免疫吸附试验试剂盒货号：FSM3849,购自上海抚生实业公司；4-羟壬烯醛和白三烯B4酶联免疫吸附试验试剂盒货号：SBJ-M0865、SBJ-M0587,购自南京森贝伽生物科技公司；HE染色试剂货号：C0105M,购自上海碧云天生物公司。TMV-100S行为学分析系统购自程度泰盟软件公司。

1.3 方法

1.3.1 药品配制：

取药材除去杂质及残茎，润透、干燥，即为生柴胡。将生柴胡与米醋以5∶1比例，闷润至米醋完全吸收，加热炒干，即为醋炙柴胡。将生柴胡、醋炙柴胡水煎后收集煎液，4 ℃下备用[6]。

1.3.2 抑郁模型的构建：

采用慢性不可预知温和应激法，每天让小鼠随机暴露于2种应激源(禁食12 h, 禁水12 h, 潮湿垫料12 h, 45°倾斜鼠笼12 h, 昼夜颠倒12 h, 束缚12 h, 足部电击30 min, 夹尾1 min, 气味刺激4 h, 40 ℃热水游泳5 min),确保3 d内应激源不重复，连续刺激4周，若小鼠出现抑郁样行为(糖水偏好率、进入旷场中心区域次数明显降低，游泳不动的时间明显延长)表明建模成功[8]。

1.3.3 动物分组与处理：

将70只雄性C57小鼠随机分为对照组、模型组、帕罗西汀组(10 mg/kg)、生柴胡低剂量组(1.5 g/kg)、生柴胡高剂量组(12 g/kg)、醋炙柴胡低剂量组(1.5 g/kg)、醋炙柴胡高剂量组(12 g/kg),每组10只。除对照组正常饲养外，其他组均采用慢性不可预知温和应激法构建抑郁模型，建模24 h后帕罗西汀组灌胃10 mg/kg帕罗西汀，柴胡适应证不同，临床剂量范围较宽，参考文献[9]以及肝郁证临床常用实际剂量，折算为小鼠给药剂量，将生、醋炙柴胡给药低剂量设定为1.5 g/(kg·d)、高剂量设定为12 g/(kg·d)。生柴胡低、高剂量组分别灌胃1.5、12 g/kg生柴胡水煎液，醋炙柴胡低、高剂量组分别灌胃1.5、12 g/kg醋炙柴胡水煎液，每日1次，连续给药15 d, 对照组、模型组以等体积生理盐水替代。

1.4 观察指标

1.4.1 抑郁样行为：

给药结束后通过糖水消耗实验、旷场实验及强迫游泳实验，测试小鼠抑郁样行为。(1)糖水消耗实验：预先准备2个相同的水瓶，内置1%蔗糖水，让小鼠适应性饮用蔗糖水1 d, 再将其中1瓶更换为蒸馏水，每12小时更换1次水瓶位置，24 h后开始正式实验，禁食禁水24 h, 随机摆放1瓶蔗糖水、1瓶蒸馏水，记录24 h内小鼠2种水的饮用量，计算糖水偏好率=蔗糖水饮用量/(蔗糖水饮用量+蒸馏水饮用量)×100%。(2)旷场实验：将小鼠放入旷场箱中央，适应1 min, 记录小鼠3 min内进入旷场中心区域的次数。(3)强迫游泳实验：于圆柱形水池中加水，水面高度为30 cm, 记录小鼠5 min内静止不动(四肢均未出现游动或偶有后肢踩水保持悬浮)的时间。

1.4.2 肝功能：

完成行为检测后，摘取小鼠眼球采血并处死，快速剖取肝组织，固定于4%多聚甲醛溶液待测。血样室温下静置20 min, 3 000 r/min离心30 min分离血清，测定血清AST、ALT和TBA含量。

1.4.3 肝组织病理变化：

将固定的小鼠肝组织制备为厚度4 μm石蜡切片，HE染色观察组织病理变化。

1.4.4 肝组织脂质过氧化物含量：

将肝组织与生理盐水以1∶9比例匀浆，3 000 r/min离心5 min, 分离上清液，测定丙二醛、4-羟壬烯醛和白三烯B4含量。

1.5 统计学方法

采用统计学软件SPSS 23.0分析数据，计量资料以均数±标准差

表示，多组比较采用单因素方差分析，事后比较采用LSD-t检验。α=0.05为检验水准。

2、结果

2.1 小鼠抑郁样行为比较

与对照组比较，模型组糖水偏好率、进入旷场中心区域时间明显降低，游泳不动时间明显延长(P<0.05)。与模型组比较，生柴胡低剂量组、醋炙柴胡低和高剂量组、帕罗西汀组糖水偏好率明显升高，生柴胡低和高剂量组、醋炙柴胡低和高剂量组、帕罗西汀组进入旷场中心区域时间明显延长，游泳不动时间明显缩短(P<0.05)。醋炙柴胡低剂量组、帕罗西汀组糖水偏好率高于生柴胡高剂量组，游泳不动时间短于生柴胡高剂量组；帕罗西汀组进入旷场中心区域时间长于生柴胡低剂量组、生柴胡高剂量组(P<0.05)。见表1。

2.2 小鼠肝功能比较

与对照组比较，模型组血清ALT、AST和TBA水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较，生柴胡低和高剂量组、醋炙柴胡低和高剂量组、帕罗西汀组血清ALT、AST和TBA明显降低(P<0.05)。醋炙柴胡低剂量组血清ALT低于生柴胡高剂量组、醋炙柴胡高剂量组(P<0.05)。见表2。

表1 7组小鼠抑郁样行为比较

表2 7组小鼠肝功能的比较

2.3 小鼠肝组织病理变化

对照组小鼠肝细胞结构清晰，排列整齐，肝细胞索呈放射状排列，肝小叶结构清晰。模型组小鼠肝细胞坏死，轻度肝血窦扩张。与模型组相比，帕罗西汀组无明显改善，生柴胡、醋炙柴胡组均有不同程度的改善，肝细胞坏死程度有所减轻。见图1。

2.4 小鼠肝组织脂质过氧化物含量比较

与对照组比较，模型组肝组织丙二醛、4-羟壬烯醛和白三烯B4含量明显升高(P<0.05)。与模型组比较，醋炙柴胡低和高剂量组、帕罗西汀组丙二醛明显降低，生柴胡低和高剂量组、醋炙柴胡低和高剂量组、帕罗西汀组4-羟壬烯醛和白三烯B4明显降低(P<0.05);且醋炙柴胡低剂量组丙二醛低于生柴胡低剂量组，4-羟壬烯醛低于生柴胡高剂量组，白三烯B4低于生柴胡低和高剂量组、醋炙柴胡高剂量组(P<0.05)。见表3。

3、讨论

目前，临床治疗抑郁症常用药物、心理干预和物理疗法，中重度患者则需要长期服用西药稳定病情，但会有不同程度的不良反应[10]。中医药具有多途径、多靶点、安全性高等优势，经辨证论治用药，在抑郁症的治疗方面应用广泛[11-12]。柴胡炮制方法众多，如熬制、酒拌/炒制、醋炙、蜜制等[13],其中醋炙柴胡在保肝方面有良好效果。董蕊等[14]研究显示，北柴胡醋炙可改善急性肝损伤，抑制模型小鼠炎症反应，减轻氧化应激损伤；刘鑫等[15]复制肝纤维化大鼠模型，发现醋炙柴胡、白芍可有效改善模型大鼠肝功能。本研究显示，经慢性不可预知温和应激法诱导后小鼠出现快感缺失，对陌生空间探索兴趣降低，绝望等抑郁样行为，而醋炙柴胡低剂量处理后可明显改善上述抑郁症表现，且效果优于生柴胡，说明柴胡醋炙后具有增效作用，与既往研究相符[16]。

图1 7组小鼠肝组织病理变化(HE×200)

对照组小鼠正常饲养，其他组小鼠均构建抑郁模型；帕罗西汀组灌胃10 mg/kg帕罗西汀，生柴胡低、高剂量组分别灌胃生柴胡1.5、12 g/kg, 醋炙柴胡低、高剂量组分别灌胃醋炙柴胡1.5、12 g/kg。

表3 7组小鼠肝组织脂质过氧化物含量比较

长期慢性应激可诱发一系列慢性疾病，其对肝脏的影响已得到证实。临床分析发现，抑郁症是影响非酒精性脂肪肝发病的独立因素[17];另有研究显示，乙肝代偿期肝硬化患者肝郁气滞证及肝郁脾虚证患者易患抑郁，且肝郁气滞证患者抑郁程度最重[18]。动物实验也发现，各种类型急性应激刺激下，大鼠肝脏会出现病理损伤[19]。本研究显示，抑郁症模型小鼠ALT、AST和TBA异常升高，肝组织细胞也出现不同程度的损伤。经生柴胡、醋炙柴胡治疗后，肝功能有所恢复，肝组织细胞坏死也减轻，以醋炙柴胡低剂量改善更佳。

据报道，慢性应激可明显改变肝脏组织结构，导致肝组织丙二醛和超氧化物歧化酶含量升高[20-21]。表明慢性应激可诱导肝脏脂质代谢紊乱。丙二醛、4-羟壬烯醛和白三烯B4均是脂质过氧化产物，其水平可评估脂质过氧化和自由基损伤程度[22-23]。本研究中，醋炙柴胡可显著降低抑郁症小鼠肝组织中丙二醛、4-羟壬烯醛和白三烯B4含量，这可能是醋炙柴胡治疗抑郁症小鼠肝损伤的潜在途径。李慧敏等[24]药理研究也表明，柴胡总黄酮含量丰富，具有抗氧化活性。

综上所述，醋炙柴胡可改善抑郁症小鼠整体状况，提高小鼠追求兴趣事物的快感，提升其空间探索能力，减轻绝望，还可改善慢性应激诱发的肝损伤，可能与降低丙二醛、4-羟壬烯醛和白三烯B4水平有关。后续将重点关注醋炙柴胡发挥抗抑郁作用的分子靶点研究，进一步揭示其抗抑郁的效果及机制。

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