子宫内膜癌在女性生殖系统恶性肿瘤中较为常见，发病率逐年升高，是由多因素、多基因、多步骤导致的，癌基因的激活，抑癌基因的失活可使导致子宫内膜癌的发生，临床多采用手术切除、术后放化疗结合治疗，该治疗方案可延长患者生命，但仍具有较高复发率[1～4]。miRNA在真核细胞中广泛存在，在细胞增殖、胚胎发育、细胞凋亡中具有重要作用，影响肿瘤的发生、发展，miRNA-30c可抑制肿瘤细胞的迁移、增殖能力[5]。肝激酶(LK)B1、p53为抑癌基因，LKB1表达缺失可促进子宫内膜癌的发生、发展，p53可促进LKB1激活，抑制肿瘤的发展[6,7]。本文探究miRNA-30c调控p53/LKB1信号通路对子宫内膜癌大鼠的干预效果。

1、材料与方法

1.1材料与研究动物

选取50只雌性SPF级Wistar大鼠，体质量200～230 g,购于深圳湾实验室，动物许可证号：SYXK(粤)2022-0287,持续7 d适应性喂养，在此过程中温度应保持在25℃、湿度应保持在70%,对食物、水进行高温高压消毒。细胞：人子宫内膜癌细胞株，购于厦门逸漠生物科技有限公司。本次试验操作均符合动物试验伦理相关规定。

1.2 miRNA-30c慢病毒载体构建

LPL基因序列利用GenBanK进行查找，并构建miRNA-30c沉默、过表达转染质粒，病毒滴度为1×109TU/ml,设计公司为上海复百澳生物科技有限公司。

1.3细胞培养

复苏子宫内膜癌细胞，将其转移至DMEM培养箱(包含10%胎牛血清)中进行培养，条件为95%N2、37℃5% CO2,待其密度到达80%,传代操作再次重复。收集对数生长期细胞，消化传代，取磷酸盐缓冲液，配制细胞悬液，其浓度为1.8×107个/ml。

1.4分组与建模

选取10只大鼠作为对照组，另外40只按照李元昆等[8]研究中子宫内膜癌大鼠的建立方法构建模型，将配制好的细胞悬液接种于大鼠右腋部皮下，每只大鼠接种0.1 ml,接种5 d后，大鼠接种部位出现椭圆形、扁平性包块，且逐渐增加，即为建模成功。建模过程中死亡10只，将其余30只分为过表达、模型组、沉默组各10只。

1.5 miRNA-30c转染

过表达组：给予10μl miRNA-30c过表达慢病毒悬液；沉默组：给予10μl miRNA-30c沉默慢病毒悬液；对照组、模型组：给予10μl生理盐水，4组均于大鼠尾静脉注射，1次/d, 10μg/次，持续5 d注射。

1.6指标观察

1.6.1一般情况观察

观察处死前各组大鼠经miRNA-30c转染后的一般情况，即形态、活动、毛发光泽度、纳食等。

1.6.2常规指标、免疫器官指数检测

利用游标卡尺测量处死大鼠前肿瘤的短经(b)与长径(a),并计算其肿瘤体积，在无菌条件下，对大鼠肿瘤、脾脏组织、胸腺进行剥离，利用天平进行称重，利用过量瓶对其腹水量进行测量。肿瘤体积=(a×b2)×1/2,抑瘤率=[模型组肿瘤重量-过表达组(沉默组)肿瘤重量]/过表达组(沉默组)肿瘤重量×100%。

1.6.3病理组织学观察

将大鼠断头处死，取大鼠肿瘤组织，固定于4%甲醛中，72 h后取出，制作病理切片，其厚度为4μm,随后采取脱蜡、脱水操作，取苏木素-伊红(HE)染色试剂盒，对其进行染色处理，利用官学显微镜对其肿瘤组织变化进行观察。

1.6.4 miRNA-30c、p53、LKB1表达量检测

将大鼠肿瘤组织置于液氮中，随即进行研磨处理，利用Takara逆转录试剂盒进行逆转录，利用实时荧光定量法对miRNA-30c、LKB1、p53表达量进行鉴定，利用Primer5.0软件对其引物序列进行设计，反应体系：20μl蒸馏水、模板DNA 1μl、0.5μl上下游引物。条件：34 s 70℃、30 s 60℃、10 min 95℃、95℃10 s、循环35个，p53、miRNA-30c、LKB1表达量利用2-ΔΔCt进行计算。内参GAPDH上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游：5′-AACGCTTCA-CGAATTTCGCT-3′。LKB1上游引物：5′-TCTAACA-ATGCGCTCATCGTCATCCTCGGC-3′,下游：5′-GGG-CTTCCACCTGGTGCCAGCCTGT-3′;miRNA-30c上游引物：5′-GCCGCTGTAAACATCCTACACT-3′,下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;p53上游引物：5′-CACAAAAACAGGTTAAACCCAG-3′,下游：5′-AGCAC-ATAGGAGGCAGAGAC-3′。

1.6.5炎症因子检测

取各组冷冻血清，解冻，利用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测，于反应孔中加入碳酸盐缓冲液稀释待测液，于4℃下过夜，舍弃，洗涤，加1%牛血清蛋白(BSA),于37℃下进行60 min孵育，后弃去，洗涤，加0.1 ml稀释抗血清，于37℃温度条件下进行40 min轻微摇晃，后弃去，洗涤，加3,3′,5,5′-四甲基苯胺(TMB)使其显色，测定450 nm下光密度(OD)值，得出白细胞介素(IL)-2、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ表达水平。

1.6.6免疫功能检测

取各组大鼠冷冻血清，进行解冻，采用流失细胞仪检测CD4+、CD8+表达水平，并计算CD4+/CD8+值。

1.6.7 p53/LKB1信号通路蛋白表达量

取肿瘤组织，运用Western印迹进行测定大鼠肿瘤组织中的p53、LKB1蛋白相对表达量，溶解，制作匀浆，离心，p53、LKB1蛋白含量利用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒检测，抽取等量蛋白质，于100℃5 min变性，分离，加一抗，4℃过夜孵育，漂洗，15 min/次，共3次，加二抗，2 h孵育，漂洗，共3次，15 min/次，内参：GAPDH,计算其相关蛋白表达。

1.7统计学处理

采用SPSS19.0软件进行方差齐性检验、重复测量的方差分析。

2、结 果

2.1一般情况观察

对照组皮毛顺滑、反应灵敏、饮食正常、活动较多；模型组食欲降低、反应迟钝、脱毛情况增加、皮毛杂乱无章、较少活动；沉默组反应迟钝、毛发枯黄、食欲不振、具有较少活动；过表达组增加食欲、减少脱毛、活动增加。

2.2各组常规指标对比

如表1所示，模型组、沉默组、过表达组腹水量显著高于对照组(P<0.05);沉默组肿瘤重量、腹水量、肿瘤体积显著高于模型组(P<0.05),过表达组肿瘤重量、腹水量、肿瘤体积显著低于模型组和沉默组(P<0.05);过表达组抑瘤率显著高于沉默组(P<0.05)。

2.3各组免疫器官指数对比

如表1所示，模型组、沉默组、过表达组胸腺指数、脾脏指数明显低于对照组(P<0.05);沉默组胸腺指数、脾脏指数明显低于模型组，过表达组胸腺指数、脾脏指数高于模型组和沉默组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表1各组常规指标、免疫器官指数对比

2.4病理学特征对比

如图1所示，对照组子宫组织细胞正常排列、形态正常，具有清晰轮廓，未出现病理改变；模型组肿瘤组织细胞排列杂乱、出现水肿，细胞数量减少；沉默组肿瘤细胞排列紊乱减轻，细胞数量减少，大部分细胞壁出现空洞；过表达组细胞数量增加，存在少量浸润。

图1各组子宫组织病理(HE染色，×100倍)

2.5各组炎症因子水平对比

如表2所示，沉默组、模型组、过表达组IFN-γ、IL-2、TNF-α水平明显高于对照组(P<0.05);与模型组相比，沉默组明显提高TNF-α、IL-2、IFN-γ水平，过表达组明显降低IFN-γ、TNF-α、IL-2表达水平(P<0.05);且过表达组IL-2、TNF-α、IFN-γ表达水平低于沉默组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

2.6各组免疫功能对比

如表2所示，与对照组相比，模型组、沉默组、过表达组CD8+、CD4+、CD4+/CD8+表达水平明显降低(P<0.05);沉默组免疫功能水平明显低于模型组，过表达组免疫功能水平明显高于模型组(P<0.05);与沉默组相比，过表达组免疫功能水平上升，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2各组炎症因子水平及免疫功能对比

2.7各组miRNA-30c相对表达量对比

如表3所示，模型组、沉默组、过表达组miRNA-30c表达量明显低于对照组(P<0.05);沉默组miRNA-30c表达量低于模型组，过表达组miRNA-30c表达量高于模型组和沉默组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

2.8各组p53、LKB1 mRNA及蛋白表达对比

如表3、图2所示，模型组、沉默组、过表达组p53、LKB1 mRNA及蛋白表达量明显低于对照组(P<0.05);与模型组相比，过表达组p53、LKB1 mRNA及蛋白表达明显上升，沉默组LKB1、p53 mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05);过表达组p53、LKB1 mRNA及蛋白表达高于沉默组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表3各组miRNA-30c相对表达量、p53、LKB1 mRNA及蛋白表达对比

图2 Western印迹检测各组p53/LKB1信号通路蛋白表达

3、讨 论

miRNA-30c为miRNA家族成员，在子宫内膜癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌等恶性组织中表达水平较低，且随着淋巴结的转移，表达逐渐降低[9]。研究显示，在卵巢癌中，miRNA-30c可作用于转录激活因子(ATF)3,对溶血磷脂酸通路进行调节，以此调控肿瘤发生、发展[10,11]。本研究显示，上调miRNA-30c表达，可降低大鼠炎症因子水平，并提高其免疫功能。相关研究表明[12],在多种恶性肿瘤中，miRNA-30c表达降低可增加恶性肿瘤的分级，使肿瘤细胞发生转移，并导致不良预后的产生，在肿瘤细胞增殖、侵袭、转移中具有重要作用，上调miRNA-30c表达，可使子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭受到抑制，促使恢复。该研究与本研究一致，表明上调miRNA-30c表达，可促使子宫内膜癌的恢复。

肿瘤发生、发展与免疫功能及炎症反应之间具有相关性，肿瘤细胞会在免疫功能降低时进行跳脱，加快肿瘤细胞发生转移[13]。胸腺、脾脏为机体内重要免疫器官，可反映机体免疫功能的强弱，脾脏中含有较多自然杀伤(NK)细胞、淋巴细胞、吞噬细胞，为机体内体液、细胞免疫的中心组织[14]。本研究显示，上调miRNA-30c表达，可使子宫内膜大鼠胸腺指数、脾脏指数升高，提升细胞免疫功能。相关学者研究显示[15],脾脏指数升高，可使淋巴细胞增殖加快，并加强巨噬细胞吞噬功能，防止机体内免疫器官的萎缩，避免免疫功能减退。该研究与本研究一致，表明过表达miRNA-30c,可使机体抗肿瘤作用增强，提高大鼠免疫功能。

研究显示[16],T淋巴细胞在肿瘤免疫系统中较为重要，T淋巴细胞亚群分布状态，可反映机体内免疫功能状态，在正常状态下，CD4+、CD8+处于平衡状态，可维持机体内免疫平衡，当恶性肿瘤发生时可使免疫平衡被打破，降低CD4+、CD8+表达。在正常生理状态下，CD4+可分泌TNF-α、IL-2、IFN-γ因子，抑制肿瘤细胞表达，恶性肿瘤的发生可大量分泌TNF-α、IL-2、IFN-γ因子，使机体免疫功能受到抑制[17]。本研究发现，过表达子宫内膜癌大鼠体内miRNA-30c,抑制TNF-α、IL-2、IFN-γ表达，提高机体内免疫功能。相关学者研究显示[18],恶性肿瘤细胞的进展，主要为机体内抗肿瘤的免疫状态决定的，机体内免疫功能受到抑制后，可增加体内炎症反应，可导致肿瘤体积增加，并发生转移。该研究与本研究一致，表明上调miRNA-30c,可使机体内免疫功能提高，并降低炎症因子表达，增加机体抗肿瘤能力。

LKB1为抑癌基因，在多种肿瘤的信号传导通路具有重要作用，可促使肿瘤细胞的凋亡，参与能量的代谢，并使肿瘤细胞增殖、转移受到抑制，维持细胞极性[19]。p53在肿瘤发生中作用较为重要，可对细胞周期阻滞进行调控，并诱导癌细胞凋亡[20]。本研究发现，上调miRNA-30c表达，可使p53、LKB1表达水平升高，抑制肿瘤的发展。相关研究显示[21],p53可对LKB1表达进行调控，使LKB1/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路激活，对机体内细胞能力代谢进行调控，使肿瘤的生长受到抑制，降低肿瘤的糖脂代谢，促使肿瘤恢复。该研究与本研究一致，表明上调miRNA-30c,可激活p53/LKB1通路，使肿瘤的发展受到抑制。

综上所述，在子宫内膜癌大鼠中增加miRNA-30c表达，可明显抑制病变，降低其炎症因子水平，有效改善免疫功能，其作用机制可能与p53/LKB1通路被激活相关。

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基金资助:河南省医学科技攻关计划(联合共建)项目(LHGJ20191351);

文章来源:孙丽莎,王虹,张娟,等.miRNA-30c调控p53/LKB1信号通路对子宫内膜癌大鼠的干预效果[J].中国老年学杂志,2024,44(21):5308-5312.