子宫内膜癌的发病机制尚未完全明确，研究发现其与抑癌基因及微小RNA(miRNA)等表达异常有关，越来越多的研究证实抑癌基因与miRNA在子宫内膜癌病情及预后评估中具有重要临床价值，其敏感度及特异性高于传统的肿瘤标志物[1,2]。细胞周期蛋白B2(cyclin B2,CCNB2)具有调控细胞周期功能，生物信息分析发现其在子宫内膜癌中表达显著上调且与临床病情及预后相关[3]。SRY-盒转录因子11(SRY-box transcription factor 11,Sox11)具有促进细胞增殖、迁移及侵袭等功能，研究发现其在子宫内膜癌中表达上调[4]。miR-21可通过多种信号通路调控子宫内膜癌细胞增殖及凋亡，与其发病机制密切相关[5,6]。目前CCNB2、Sox11及miR-21在子宫内膜癌病情及预后评估中的临床价值尚未明确。本研究检测子宫内膜癌患者CCNB2、Sox11及miR-21表达，研究CCNB2、Sox11及miR-21在子宫内膜癌病情及预后评估中的临床价值。

1、资料与方法

1.1 临床资料

选择2015年1月至2017年12月诊治的98例子宫内膜癌患者为研究对象(EMC组)。入选标准：①经病理组织学检查确诊；②首次诊治，既往无子宫内膜癌病史，未行手术、放疗、化疗及靶向药物等治疗；③KPS评分≥70分，预计生存期≥3个月，临床资料完整；④排除合并其他肿瘤、严重心肺血管病及子宫附件继发性肿瘤等，排除合并精神神经疾病；⑤患者及家属知情并同意本研究。另选择同期50例子宫内膜良性疾病(包括子宫内膜息肉等)患者为对照(CON组)。两组患者基线资料见表1,在年龄、KPS评分、体质量指数、HPV感染、孕次、产 次及绝经史方面具有可比 性(均P>0.05)。本研究获得医院医学伦理委员会审批批准。

表1 EMC组及CON组研究对象基线临床资料比较x¯±s/n

1.2 材料与试剂

正常人子宫内膜上皮细胞(HEMEC)、子宫内膜癌细胞(Ishikawa、ECC-1、Hec50co和RL95-2)购自武汉普诺赛公司；实时荧光定量PCR(RT-qPCR)相关试剂购自上海碧云天公司；引物由大连宝生物公司合成纯化；细胞培养基购自北京天根公司。RT-qPCR机器为美国ABI公司的HT9700。CCNB2、Sox11等一抗购自美国Abcam公司。蛋白质提取及检测相关试剂盒购自武汉博士德公司。

1.3 CCNB2、Sox11及miR-21表达检测

EMC组子宫内膜癌患者取肿瘤组织及癌旁组织，CON组患者取子宫内膜组织。采用RT-qPCR法检测EMC组肿瘤组织及癌旁组织、CON组子宫内膜组织、HEMEC、子宫内膜癌细胞 系(Ishikawa、ECC-1、Hec50co和RL95-2)中CCNB2、Sox11及miR-21表达，其中CCNB2上游引物序列5'-CAACCCACCAAAACAACA-3',下游引物序列5'-AGAGCAAGGCATCAGAAA-3';Sox11上游引物序列5'-GGTGGATAAGGATTTGGATTCG-3',下游引物序列5'-GCTCCGGCGTGCAGTAGT-3';miR-21引物序列5'-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3'。反 应体系为25 μL,反应条件 为50 ℃孵育20 min, 95 ℃预变性1 min; 55 ℃退火1 min, 65 ℃延伸扩增45 s, 35个循环，最后一轮72 ℃反应5 min。CCNB2、Sox11选择GAPDH为内参，miR-21选择U6为内参，采用2-△△ct计算CCNB2、Sox11及miR-21相对表达量。

1.4 CCNB2、Sox11蛋白表达检测

EMC组子宫内膜癌患者取肿瘤组织及癌旁组织，CON组患者取子宫内膜组织。采用蛋白质印迹法(Western blot)检测EMC组肿瘤组织及癌旁组织、CON组子宫内膜组织、HEMEC、子宫内膜癌细胞系(Ishikawa、ECC-1、Hec50co和RL95-2)中CCNB2、Sox11蛋白表达。提取上述各组组织或细胞总蛋白后纯化并定量，转膜及凝胶电泳后显影拍照，选择β-actin采用Image plus计算CCNB2、Sox11相对表达量。

1.5 临床病理资料收集

收集EMC组和CON组患者一般临床资料、HPV感染、分子分型[7]、组织学分级、病理类型、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、FIGO分期等资料。

1.6 预后及随访调查

本组子宫内膜癌患者每3个月电话或门诊随访1次，内容包括：①生存情况；②治疗情况，包括药物治疗等；③评价当前身体状况；④治疗前、治 疗后症状体征；⑤体格检 查；⑥影像学检查。随访时间至2023年3月(随访终点)。统计患者生存期、预后终点事件(死亡或存活)。

1.7 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据的处理。计量资料采用均数±标准差(x¯±s)

表示。两组间均数比较采用t检验。计数采用χ2检验。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清CCNB2、Sox11及miR-21预测子宫内膜癌患者死亡的效能。多因素Logistic回归分析子宫内膜癌预后的影响因素。Kaplan-Meier法分析CCNB2、Sox11及miR-21表达与生存期的关系。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 CCNB2、Sox11及miR-21表达

EMC组患者肿瘤组织中CCNB2、Sox11及miR-21相对表达量均显著高于癌旁组织及CON组，差异有统计学意义(均P<0.05)(表2)。Ishikawa、ECC-1、Hec50co和RL95-2子宫内膜癌细胞中CCNB2、Sox11及miR-21相对表达量均显著高于HEMEC细胞，差异有统计学意义(均P<0.05)(图1)。

表2 EMC组和CON组患者CCNB2、Sox11及miR-21相对表达量x¯±s

图1 各组细胞中CCNB2、Sox11及miR-21表达   

2.2 CCNB2、Sox11蛋白表达

EMC组患者肿瘤组织中CCNB2、Sox11蛋白表达均显著高于癌旁组织及CON组，差异有统计学意义(均P<0.05)(表3)。Ishikawa、ECC-1、Hec50co和RL95-2子宫内膜癌细胞中CCNB2、Sox11蛋白表达量均显著高于HEMEC细胞，差异有统计学意义(均P<0.05)(图2)。

表3 EMC组和CON组患者CCNB2、Sox11蛋白表达比较x¯±s

图2 各组细胞中CCNB2、Sox11蛋白表达  

2.3 CCNB2、Sox11及miR-21表达与临床病理因素的关系

EMC组患者肿瘤组织在年龄、HPV感染、是否绝经、病理类型及分子分型中的CCNB2、Sox11及miR-21表达的差异无统计学意义(均P>0.05),在分化程度、组织学分级、肌层浸润深度、淋巴结转移及FIGO分期中的差异有统计学意义(均P<0.05)(表4)。

表4 子宫内膜癌肿瘤组织中CCNB2、Sox11及miR-21表达与临床病理因素的关系x¯±s

2.4 CCNB2、Sox11及miR-21表达预测子宫内膜癌患者死亡效能

以随访结束为时间终点统计患者死亡事件，CCNB2、Sox11及miR-21表达预测子宫内膜癌患者死亡截断值分别为1.2、0.8、1.5,敏感度分别为0.771、0.827、0.833,特异性分别为0.785、0.762、0.701(图3、表5)。

图3 CCNB2、Sox11及miR-21表达预测子宫内膜癌患者死亡的ROC曲线   

2.5 子宫内膜癌患者死亡危险因素分析

以本组子宫内膜癌患者分化程度、组织学分级、肌层浸润深度、淋巴结转移、FIGO分期、CCNB2相对表达量、Sox11相对表达量及miR-21相对表达量为自变量，预 后状况(死亡或存活)为因变量行Logistic多因素分析，变量赋值 见表6。分析结果显示低分化、组织学分级G3、肌层浸润深度>1/2、有淋巴结转移、III期、CCNB2相对表达量≥1.2、Sox11相对表达量≥0.8、miR-21相对表达量≥1.5为子宫内膜癌患者死亡的危险因素(P<0.05)(表7)。

2.6 CCNB2、Sox11及miR-21表达与子宫内膜癌患者生存期的关系

本组子宫内膜癌中CCNB2表达≥1.2且Sox11表达≥0.8且miR-21表达≥1.5患者中位生存期显著低于其他(CCNB2表达<1.2或Sox11表达<0.8或miR-21表达<1.5)患者[中位生存期(27.2±6.4)月比(32.5±6.8)月，Logrank=9.821,P<0.05](图4)。

图4 CCNB2、Sox11及miR-21表达与子宫内膜癌患者生存期的关系  

3、讨论

CCNB2为细胞周期蛋白家族成员，与Cdc3结合后可通过促进细胞周期G2期进入M期发挥调控细胞周期功能[8]。CCNB2在细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及上皮间质转化中具有重要作用，在乳腺癌等多种恶性肿瘤中表达上调，与多种恶性肿瘤恶性程度及TNM分期相关，可为多种恶性肿瘤病情及预后评估提供基因水平的证据[9,10]。生物信息学分析发现子宫内膜癌组织CCNB2基因mRNA及蛋白表达均显著上调，与其分期、年龄、更年期状态、组织学亚型、TP53突变状态相关，CCNB2基因mRNA高表达患者预后及生存期较差，推测CCNB2基因与子宫内膜癌发病机制相关且在其病情及预后评估中具有重要价值。本研究中，子宫内膜癌患者肿瘤组织CCNB2基因mRNA表达显著高于癌旁组织及子宫内膜良性疾病患者，子宫内膜癌细胞CCNB2基因mRNA表达显著高于正常子宫内膜细胞，表明CCNB2基因与子宫内膜癌发病机制相关。本研究进一步发现CCNB2表达与分化程度、组织学分级、肌层浸润深度、淋巴结转移及FIGO分期、生存期及死亡风险密切相关，表明CCNB2可作为子宫内膜癌病情及预后评估的标志物。

表5 CCNB2、Sox11及miR-21表达预测子宫内膜癌患者死亡截断值、敏感度及特异性

表6 子宫内膜癌患者死亡危险因素多因素Logistic分析变量赋值表

Sox11为SOXC转录因子家族成员，为器官生长发育过程中细胞生存及分化的主要调节因子，研究发现Sox11与恶性肿瘤的发生、发展及转归相关[11,12]。Sox11在不同的肿瘤组织中表达不同，具有癌基因及抑癌基因双重作用，其癌基因功能表现为抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、抑制肿瘤细胞分化及增加肿瘤细胞侵袭和迁移等[13]。XU XD[14]检测子宫内膜癌Sox11表达并研究其与血管新生的关系，发现子宫内膜癌中Sox11阳性率显著高于子宫内膜癌前病变及正常子宫内膜，且子宫内膜癌Sox11阳性率与微血管密度正相关。本研究中，子宫内膜癌患者肿瘤组织Sox11基因mRNA表达显著高于癌旁组织及子宫内膜良性疾病患者，子宫内膜癌细胞Sox11基因mRNA表达显著高于正常子宫内膜细胞，表明Sox11基因与子宫内膜癌发病机制相关。本研究进一步发现Sox11表达与分化程度、组织学分级、肌层浸润深度、淋巴结转移及FIGO分期、生存期及死亡风险密切相关，表明Sox11在子宫内膜癌病情及预后评估中具有重要价值。

表7 子宫内膜癌患者死亡影响因素的多因素Logistic分析

子宫内膜癌的发病机制与遗传因素及环境因素相关，其中遗传因素包括miRNA及相关基因调控异常，miRNA为内源性非编码单链RNA,主要是通过降解mRNA或抑制蛋白质翻译来调控转录后基因表达，在细胞增殖、凋亡、上皮间质转化等多种生物学过程中发挥重要作用[15]。研究发现，miRNA 表达的异常与子宫内膜癌发生与发展有关，包括子宫内膜癌在内的多种恶性肿瘤均可检测到miRNA表达异常，在子宫内膜癌病情及预后评估、临床诊疗中具有重要作用[16,17]。miR-21可通过多种机制调控细胞增殖、迁移及侵袭，在多种恶性肿瘤发病机制、病情及预后评估中具有重要价值[18,19,20,21]。研究发现miR-21在子宫内膜癌中表达升高且与病情和预后相关，联合阴道彩超及血清HE4可用于子宫内膜癌诊断[22]。本研究中，子宫内膜癌患者肿瘤组织miR-21表达显著高于癌旁组织及子宫内膜良性疾病患者，子宫内膜癌细胞miR-21表达显著高于正常子宫内膜细胞，表明miR-21与子宫内膜癌发病机制相关。本研究进一步发现miR-21表达与分化程度、组织学分级、肌层浸润深度、淋巴结转移及FIGO分期、生存期及死亡风险密切相关，表明miR-21在子宫内膜癌病情及预后评估中具有重要价值。

目前子宫内膜癌病情及预后评估常用的方法包括肿瘤标志物、影像学检查FIGO分期等，前者存在敏感度及特异性低等缺点，后者存在受检查者主观因素影响大、可重复性及普适性差等缺点[23],故探讨新型的病情及预后评估的标志物在子宫内膜癌的诊疗中具有重要价值。随着对子宫内膜癌发病机制的深入研究及分子检测水平的提高，基因水平的标志物可能在子宫内膜癌病情及预后评估中具有更高的敏感度及特异性，具有检测快捷方便等优点[24,25]。本研究CCNB2、Sox11及miR-21预测子宫内膜癌患者死亡截断值分别为1.2、0.8、1.5,敏感度分别为0.771、0.827、0.833,特异性分别为0.785、0.762、0.701,进一步研究发现子宫内膜癌中CCNB2表达≥1.2且Sox11表达≥0.8且miR-21表达≥1.5患 者中位生存期显著低于CCNB2表 达<1.2或Sox11表达<0.8或miR-21表达<1.5患者，这些证据表明CCNB2、Sox11及miR-21与子宫内膜癌病情及预后相关，可作为子宫内膜癌病情及预后评估的标志物。

综上所述，子宫内膜癌患者CCNB2、Sox11及miR-21表达显著升高，与分化程度、组织学分级、肌层浸润深度、淋巴结转移及FIGO分期、生存期及死亡风险密切相关，可作为子宫内膜癌病情及预后评估的标志物。值得注意的是，本研究为单中心研究且病例数较少，CCNB2、Sox11及miR-21在子宫内膜癌病情及预后评估中的价值有待于 大规模研究证实。

参考文献:

[1]王甜甜,王晴,庄涛,等.铁死亡相关蛋白SLC7 A11与miRNA-375在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义[J].现代肿瘤医学,2023,31(5):904-911.

[2]李儒彩,潘英连,蔡兴锐,等.miR-762对子宫内膜癌Ishikawa细胞放疗敏感性的影响及机制研究[J].现代肿瘤医学,2023,31(10):1805-1810.

[7]中国抗癌协会妇科肿瘤专业委员会,中华医学会病理学分会,国家病理质控中心.子宫内膜癌分子检测中国专家共识(2021年版)[J].中国癌症杂志,2021,31(11):1126-1144.

[20]袁挺,韩川,孙妮娜,等.miR-21通过靶向SOX2增强胃癌细胞的迁移能力[J].现代肿瘤医学,2019,27(19):3361-3364.

[21]薛金慧,和莹莹,刘芮菡,等.miR-21通过靶基因ZNF326调控乳腺癌细胞侵袭､迁移的分子机制研究[J].现代肿瘤医学,2020,28(06):906-912.

文章来源:封玲,史爱红,张蓓.CCNB2､Sox11及miR-21在子宫内膜癌中的表达及临床意义[J].现代肿瘤医学,2023,31(24):4601-4606.