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热疗与吉西他滨通过ROS/JNK通路对膀胱癌细胞凋亡和自噬影响

2024-11-25 65 上传者：管理员

摘要：目的探讨热疗联合吉西他滨通过活性氧(ROS)/c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路对膀胱癌细胞凋亡和自噬的影响。方法将EJ细胞分为对照组(control)、热疗42℃组(热疗组)、吉西他滨(4 ng/ml)组(吉西他滨组)、热疗42℃+吉西他滨(4 ng/ml)组(联合组)、联合组+N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC,ROS抑制剂)组、联合组+Sp600125(JNK抑制剂)组。噻唑蓝(MTT)检测细胞活性；克隆形成实验检测细胞增殖能力；流式细胞术检测细胞凋亡；2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针检测细胞ROS水平；透射电镜观察细胞自噬小体形成；Western印迹检测蛋白表达。结果根据MTT实验结果选择42℃热疗和4 ng/ml吉西他滨干预EJ细胞。与control组比较，热疗组、吉西他滨组和联合组EJ细胞活性、P62蛋白表达明显下降，克隆形成数目、细胞凋亡率、ROS水平、自噬小体数量、苄氯素(Beclin)-1、微管相关蛋白1A/1B-轻链(LC3)Ⅱ/Ⅰ蛋白水平、p-JNK/JNK蛋白表达明显上升，其中以联合组干预效果最为显著(P<0.05),与联合组比较，联合组+NAC组、联合组+Sp600125组细胞活性、P62蛋白表达明显上升，克隆形成数目、细胞凋亡率、ROS水平、自噬小体数量、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平、p-JNK/JNK蛋白表达明显下降，通路抑制剂组明显逆转了联合组对于EJ细胞促进自噬和凋亡的作用(P<0.05)。结论热疗联合吉西他滨通过激活ROS/JNK通路，促进膀胱癌细胞EJ细胞凋亡和自噬。

关键词：
吉西他滨
活性氧(ROS)/c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路
热疗
细胞凋亡
自噬
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膀胱癌泌尿系统最常见的恶性肿瘤，且男性的发病率和死亡率大约是女性的4倍，总生存率仍不令人满意[1]。并且膀胱癌具有较强的肌肉浸润性，容易扩散转移到其他气管，因此迫切需要新的膀胱癌治疗方法[2]。促进细胞凋亡是癌症疾病的治疗目标，研究发现激活活性氧(ROS)释放，诱导自噬发生，可以促进细胞凋亡[3],自噬是一种独特的自我保护机制，也是真核细胞内稳态的调节剂，在正常情况下，自噬通过调节生理细胞过程(如增殖、分化、衰老、细胞死亡和防御病原体)来保障细胞存活，而在癌症中，自噬可以促进肿瘤活性也可以抑制肿瘤活性，具体取决于细胞环境。营养缺乏、缺血、缺氧和再灌注损伤会改变体内平衡，降低细胞的抗氧化能力并导致ROS生成过多，ROS积累引起氧化损伤，导致线粒体功能障碍，可能诱发自噬，最终引发细胞死亡[4～6]。在癌症治疗中热疗是一种辅助治疗手段，可以加强放化疗的治疗效果，在前列腺癌[7]、骨癌[8]中已被证实热疗对于肿瘤具有抑制作用。传统的化疗药物如吉西他滨在癌症治疗过程中容易产生耐药性，并具有一定毒性，而联合热疗进行辅助治疗后，其治疗可行性及疗效提高，并且药物毒性有所减轻[9]。热疗对癌细胞的多效性作用已被充分证明，然而热疗联合吉西他滨抗癌作用的机制报道甚少，研究发现，热疗联合吉西他滨较单一疗法治疗，明显抑制了肺癌细胞的活性，促进ROS释放，激活自噬，诱导细胞凋亡[10]。本研究以膀胱癌EJ细胞为研究对象，探讨热疗联合吉西他滨调节ROS/c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路，对膀胱癌自噬和凋亡的作用。

1、材料和方法

1.1材料

EJ细胞购自中国科学院细胞库；吉西他滨购自天津西典化学科技有限公司；DMEM培养基(含青霉素链霉素双抗)、胎牛血清购自北京索莱宝科技有限公司；2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针、噻唑蓝(MTT)试剂盒、膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(AnnexinⅤ-FITC)细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；苄氯素(Beclin)-1、微管相关蛋白1A/1B-轻链(LC)3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62、JNK、p-JNK、GAPDH抗体购自艾博抗(上海)贸易有限公司。透射电镜购自日本电子；酶标仪、流式细胞仪购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.2细胞培养

将EJ细胞置于DMEM培养基(添加10%胎牛血清)中培养，置于37℃,5%CO2的细胞培养箱中，培养基每2 d更换一次，待细胞融合达到70%时，进行传代，使用传至第五代的细胞进行后续实验。

1.3热疗温度与药物浓度筛选

分别设置37、40、42℃热疗处理EJ细胞；吉西他滨(0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 ng/ml)处理细胞，同时处理24 h。收集细胞，MTT法检测细胞活性，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.4细胞分组与培养条件

将细胞分为正常对照(control)组、热疗42℃(热疗)组、吉西他滨(4 ng/ml)组(吉西他滨组)、热疗42℃+吉西他滨(4 ng/ml)组(联合组)、联合组+N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)(ROS抑制剂)组、联合组+Sp600125(JNK抑制剂)组。细胞正常培养条件为37℃、5% CO2、95%以上湿度；热疗培养条件为42℃、5% CO2、95%以上湿度；其中control组在正常培养条件下培养1 h;热疗组在热疗条件下培养1 h;吉西他滨组在细胞培养基中加入吉西他滨，使其终浓度为4 ng/ml,置于正常培养条件下培养1 h;联合组采用先化疗后热疗的方式培养：根据吉西他滨组处理方式1 h后，更换培养条件为热疗1 h;联合组+NAC组：细胞在NAC溶液中预处理20 min后，根据联合组处理方式培养；联合组+Sp600125组：细胞在Sp600125溶液中预处理20 min后，根据联合组处理方式进行培养。

1.5平板克隆形成实验

收集各组细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，以1 000个左右的细胞接入6孔板，置于正常培养条件下培养，持续14 d,期间及时更换培养基。培养结束后，弃去培养基。加入甲醇固定后，使用结晶紫染色，光学显微镜观察，并拍照，计算细胞克隆数目，评估细胞增殖能力。

1.6细胞ROS水平检测

收集各组细胞，PBS洗涤，加入DCFH-DA荧光探针(10μmol/L),在细胞培养箱中培养20 min,培养期间间隔5 min混匀一次，使探针与细胞接触充分。使用无血清培养基洗涤细胞3次，收集细胞，使用无血清培养基重悬细胞，使用酶标仪在激发波长488 nm、发射波长525 nm下，测定荧光强度，以平均荧光强度(MFI)代表ROS水平。

1.7细胞凋亡检测

收集各组细胞，胰蛋白酶消化，离心收集细胞，使用无血清培养基重悬细胞，分别加入5μl Annexin V-FITC和5μl碘化丙啶(PI)染液，混匀，室温培养15 min,待流式细胞仪检测。

1.8细胞自噬观察

收集按照1.4处理的细胞，PBS洗涤3次，胰蛋白酶消化后，乙醇梯度脱水，使用环氧丙烷置换，包埋切片，枸橼酸铅电子染色，最后用透射电镜观察摄片。

1.9 Western印迹检测蛋白表达

收集按照1.4处理的细胞，PBS洗涤后，加入RIPA裂解液提取总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。加入适量蛋白预变性，电泳、转膜、脱脂牛奶封闭2 h后，洗膜，加入一抗Beclin-1(1∶1 000)、LC3Ⅱ(1∶1 000)、LC3Ⅰ(1∶1 000)、P62(1∶1 000)、JNK(1∶1 000)、p-JNK(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000),4℃过夜，加入二抗(1∶2 000),电化学发光(ECL)显色，计算各目的蛋白条带灰度值。

1.10统计学分析

采用SPSS26.0软件行t检验。

2、结果

2.1最适热疗温度和最适吉西他滨浓度的筛选

与37℃[(98.21±0.05)%]比较，40℃和42℃热疗下细胞活性明显下降[(91.12±0.12)%、(80.36±0.15)%,P<0.05],其中42℃热疗细胞活性最弱，对于细胞的抑制作用最强；与0.0 ng/ml[(99.36±0.02)%]比较，吉西他滨(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ng/ml)均能明显抑制EJ细胞活性[(93.21±0.05)%、(90.75±0.13)%、(83.02±0.15)%、(62.78±0.12)%、(35.36±0.12)%、(19.14±0.10)%,P<0.05],选择细胞存活率在70%以上的浓度作为后续实验浓度。后续实验使用42℃热疗和4 ng/ml吉西他滨干预。

2.2热疗联合吉西他滨处理对ROS/JNK通路标志物JNK、p-JNK表达的影响

与control组比较，热疗组、吉西他滨组和联合组EJ细胞p-JNK/JNK表达明显升高(P<0.05);与热疗组、吉西他滨组比较，联合组EJ细胞p-JNK/JNK表达明显升高(P<0.05);与联合组比较，联合组+NAC组、联合组+Sp600125组p-JNK/JNK表达明显下降(P<0.05)。见图1、表1。

2.3热疗联合吉西他滨处理对EJ细胞ROS的影响

与control组比较，热疗组、吉西他滨组和联合组EJ细胞ROS水平明显上升(P<0.05);与热疗组、吉西他滨组比较，联合组EJ细胞ROS水平明显上升(P<0.05);与联合组比较，联合组+NAC组、联合组+Sp600125组ROS水平明显下降(P<0.05)。见表1。

2.4热疗联合吉西他滨处理对EJ细胞增殖能力的影响

与control组比较，热疗组、吉西他滨组和联合组EJ细胞克隆形成数目明显下降(P<0.05);与热疗组、吉西他滨组比较，联合组EJ细胞克隆形成数目明显下降(P<0.05);与联合组比较，联合组+NAC组、联合组+Sp600125组，EJ细胞克隆形成数目明显上升(P<0.05)。见表1。

2.5热疗联合吉西他滨处理对EJ细胞凋亡的影响

与control组比较，热疗组、吉西他滨组和联合组EJ细胞凋亡率明显上升(P<0.05);与热疗组、吉西他滨组比较，联合组EJ细胞凋亡率明显上升(P<0.05);与联合组比较，联合组+NAC组、联合组+Sp600125组EJ细胞凋亡率明显下降(P<0.05)。见表1、图2。

2.6热疗联合吉西他滨处理对EJ细胞自噬发生的影响

如图3所示，control组EJ细胞质内可见线粒体、粗面内质网、核糖体等，出现较多自噬和脂滴；热疗组、吉西他滨组和联合组EJ细胞发生明显死亡，细胞核皱缩、染色质聚集，细胞质内大量自噬形成，其中联合组EJ细胞自噬形成最多；联合组+NAC组、联合组+Sp600125组EJ细胞细胞质内见线粒体、粗面内质网和核糖体，可见较多自噬和少量脂滴。

2.7热疗联合吉西他滨处理对EJ细胞自噬相关蛋白表达的影响

与control组比较，热疗组、吉西他滨组和联合组EJ细胞Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平明显上升，P62蛋白表达明显降低(P<0.05);与热疗组、吉西他滨组比较，联合组EJ细胞Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平明显上升，P62蛋白表达明显降低(P<0.05);与联合组比较，联合组+NAC组、联合组+Sp600125组，EJ细胞Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平明显下降，P62蛋白表达明显上升(P<0.05)。见表1、图4。

图1 Western印迹检测EJ细胞JNK、p-JNK表达

1～6:control组、热疗组、吉西他滨组、联合组、联合组+NAC组、联合组+NAC组；图4同

表1各组EJ细胞JNK、p-JNK蛋白表达、ROS水平、克隆形成数目、细胞凋亡、细胞自噬蛋白表达

图2流式细胞术检测各组EJ细胞凋亡

图3各组EJ细胞自噬小体形成(透射电镜，×10 000)

图4 Western印迹检测各组EMT标志蛋白表达

3、讨论

膀胱癌浸润转移性较强，约有30%的膀胱癌患者表现为肌层浸润性膀胱癌，5%的患者表现为转移性膀胱中为总生存期不佳[11]。大量研究证明了热疗及吉西他滨的抗癌作用[12,13],但是热疗联合吉西他滨对于膀胱癌的治疗作用鲜有报道。

热疗在过去的几十年内已成为一种恶性肿瘤治疗的新兴策略，在癌症治疗过程中，免疫疗法可以激活人体自然防御机制来预防和攻击癌细胞，而高热消融肿瘤可以激活免疫反应，对癌症进行治疗[14]。本研究中，经过热疗处理，EJ细胞活性明显下降，自噬通路被激活，诱导细胞发生凋亡。吉西他滨是经典的癌症治疗药物，在未发生远端转移的癌症患者中使用吉西他滨单一治疗，也具有一定的临床治疗效果[15]。在本研究中，经过吉西他滨处理，EJ细胞明显被抑制，并且凋亡数目增多。在转移性癌症中，化疗联合热疗已被证明具有良好的治疗效果，如在转移性胰腺癌患者中，化疗药物联合热疗可以明显改善转移性胰腺癌患者的生存期[16];热疗还可以提高化疗药物的溶解度，增强化疗药物的治疗效果，在膀胱癌患者中，热疗作为膀胱内治疗的辅助手段将改善药物溶解度，能改善药物递送效率[17],提示热疗在化疗辅助治疗中具有重要价值。

ROS/JNK通路在癌症发生发展中发挥重要作用，在结直肠癌中，药物处理提高了ROS水平，激活了JNK,增加JNK的磷酸化表达，最终导致细胞死亡，说明癌细胞凋亡涉及ROS/JNK通路的参与[18]。ROS在细胞内大量产生，导致氧化应激反应，过氧化氢可以引起线粒体损伤，激活自噬和细胞凋亡[19]。本研究发现，ROS和JNK的抑制剂明显抑制了联合组对于膀胱癌细胞凋亡和自噬的促进作用，说明热疗和吉西他滨诱导细胞凋亡和自噬是通过ROS/JNK通路实现的。

基金资助:河北省医学科学课题研究计划(20231360);

文章来源:李富博,饶井芬,李青山.热疗联合吉西他滨通过ROS/JNK通路对膀胱癌细胞凋亡和自噬的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(22):5556-5560.