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全自动细胞DNA定量分析联合细胞病理学检查的诊断价值

2020-10-13 168 上传者：管理员

摘要：目的探讨全自动细胞DNA定量分析、细胞病理学检查及两法联合在良恶性浆膜腔积液中的诊断价值。方法回顾性收集230例浆膜腔积液患者的积液标本的细胞病理学检查结果及全自动细胞DNA定量分析结果,以活检病理结果结合临床最终诊断为“金标准”,统计两种方法单独及两法联合在良恶性浆膜腔积液诊断中的符合率。结果全自动细胞DNA定量分析技术诊断恶性浆膜腔积液的灵敏度略高于细胞病理学检查(73.5%vs.72.3%),特异度低于细胞病理学检查(89.8%vs.96.6%)。两法联合诊断恶性浆膜腔积液的约登指数和受试者工作特征曲线(ROC曲线)的曲线下面积均高于单一细胞病理学检查(约登指数为0.733vs.0.689,ROC曲线下面积为0.892vs.0.853,P<0.001)或全自动细胞DNA定量分析(约登指数为0.733vs.0.633,ROC曲线下面积为0.892vs.0.832,P<0.001),差异均有统计学意义。结论全自动细胞DNA定量分析技术联合传统的细胞病理学检查可明显提高恶性浆膜腔积液的检出率。

关键词：
DNA定量分析
检出率
浆膜腔积液
病理学
细胞诊断学
肿瘤基础
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浆膜腔包括胸膜腔、腹膜腔和心包腔，浆膜腔积液的性质分为良性和恶性，其出现常提示有潜在病理改变。通过浆膜腔积液诊断良恶性肿瘤是临床上常用的方法，浆膜腔积液的良恶性关乎病情的治疗策略，因此对其性质的鉴别至关重要。目前，常用的细胞病理学检查诊断恶性积液的灵敏度为50%～70%，特异度接近100%[1]。虽然细胞病理学检查的特异度很高，但其低灵敏度并不能满足临床诊断的需要。全自动细胞DNA定量分析是一种新型的诊断技术，可通过自动检测异倍体细胞来识别恶性肿瘤，在宫颈癌、乳腺癌、子宫内膜癌、食管癌、口腔肿瘤等多种肿瘤早期诊断中取得了较高的诊断价值[2,3,4]，但在浆膜腔积液中的研究报道较少[5,6]。本研究对细胞病理学检查、全自动细胞DNA定量分析及两法联合使用与组织病理学进行对照研究，旨在探讨细胞病理学检查和全自动细胞DNA定量分析在良恶性浆膜腔积液中的诊断价值。

1、资料与方法

1.1一般资料

收集本院病理科2017年1月至2018年7月的230例浆膜腔积液患者临床资料。其中男122例，女108例；年龄26～95岁，中位年龄68岁；标本来源于胸腔142份，腹腔86份，心包腔2份。同时，收集230例患者的病史及随后的原发部位活检结果，共包含转移癌82例，淋巴瘤1例，良性积液147例；转移癌中原发部位包含肺29例，胃9例，胰腺9例，卵巢及输卵管9例，结直肠8例，子宫体及宫颈5例，乳腺4例，前列腺2例，胆管及壶腹2例，阑尾2例，肝2例，肾1例。

1.2仪器与试剂

LDDNA-ICM2型细胞DNA定量分析仪及Feulgen染色法所用DNA染液均购自武汉兰丁医学高科有限公司，细胞保存液购自北京奥特邦润生物科技有限公司，免疫组织化学（免疫组化）试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3方法

取适量浆膜腔积液于50mL离心管中，2000r/min离心5min，弃上清液，向沉渣中加入适量细胞保存液，充分混匀，取适量沉渣混合液制作2张薄层液基细胞学涂片，其中一张涂片行Feulgen染色，采用LDDNA-ICM2型细胞DNA定量分析仪进行DNA定量分析，另一张涂片行巴氏染色，观察细胞形态。剩余沉渣混合液再次离心5min，弃上清液，将沉渣常规脱水、浸蜡、包埋，制成细胞块，制作HE染色切片，观察细胞形态，阳性者辅以免疫组化染色以明确原发部位。

1.3.1细胞病理学检查

由2位细胞病理医生阅片，采用传统四级分类法[1,7]，诊断结果分为：（1）炎性反应（包括急性炎性反应、结核和慢性炎性反应）积水，未找到肿瘤细胞；（2）找到非典型细胞，倾向于反应性改变；（3）找到可疑肿瘤细胞；（4）找到肿瘤细胞。将（3）和（4）归入阳性组，（1）和（2）归入阴性组。

1.3.2细胞DNA定量分析

按照兰丁全自动细胞DNA定量分析系统操作说明进行参数设定、玻片扫描和分析，系统可对4000个以上的细胞核进行自动聚焦测定。细胞核DNA含量用C(content）表示，二倍体细胞（G1/G0期）DNA含量为2C，当DNA含量为4C时，多为四倍体细胞（G2/M期），当DNA含量≥5C的细胞判读为异倍体细胞。（1）恶性：异倍体细胞数≥3个，或可见细胞异倍体峰（DNA含量在2C～4C形成峰）。（2）可疑恶性：可见少量异倍体细胞，个数<3个。（3）正常：未见异倍体细胞。将（1）和（2）归入阳性组，（3）归入阴性组。

1.4统计学处理

采用SPSS19.0统计学软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。绘制受试者工作曲线（ROC曲线），观察曲线下面积，计算细胞病理学检查、细胞DNA定量分析及二者联合检查的灵敏度、特异度、准确率、阳性预测值、阴性预测值、假阳性率、假阴性率、约登指数评估诊断效能。ROC曲线下面积及约登指数越大，说明诊断效能越高。细胞病理学检查联合细胞DNA定量分析诊断结果遵循：两法中任一结果为阳性时，联合诊断结果为阳性，两法均为阴性时，联合诊断结果为阴性。

2、结果

2.1细胞病理学检查

230例浆膜腔积液标本中，细胞病理学检查阳性65例，阴性165例，阳性病例中，找到肿瘤细胞44例，可疑肿瘤细胞21例，见表1。其中35例经过免疫组化染色明确了原发部位。细胞病理学检查结果中165例诊断为阴性，组织学最终确诊为恶性的为23例，因此，细胞病理学检查结果为良性时，其恶性风险为13.9%(23/165）。

表1细胞病理学检查、细胞DNA定量分析及两法联合诊断结果（n)

注：恶性，异倍体细胞数≥3个或见异倍体峰；可疑恶性，异倍体细胞数1～2个。

2.2细胞DNA定量分析

230例浆膜腔积液标本中，细胞DNA定量分析阳性76例，阴性154例，见表1。阳性病例和阴性病例的代表性直方图和细胞点阵分布图见图1～4。阳性病例中，44例异倍体细胞数≥3个或见异倍体峰，32例异倍体细胞数1～2个。细胞DNA定量分析结果为阴性时，其最终诊断恶性的风险为14.3%(22/154）。

图1恶性浆膜腔积液DNA含量和细胞数量坐标图

图2恶性浆膜腔积液DNA含量和细胞核面积坐标图

2.3细胞病理学检查、细胞DNA定量分析及两法联合诊断比较

230例浆膜腔积液标本中，两法联合诊断阳性89例，阴性141例，见表1。细胞病理学检查、细胞DNA定量分析及两法联合诊断的灵敏度、特异度、准确率、阳性预测值、阴性预测值、假阳性率、假阴性率、约登指数及ROC曲线下面积见表2。细胞DNA定量分析与细胞病理学检查比较，灵敏度略高于后者，特异度低于后者，但二者的约登指数（0.633vs.0.689）和ROC曲线下面积（0.832vs.0.853）差异无统计学意义（P=0.099）。两法联合诊断的约登指数和ROC曲线下面积均高于单一细胞病理学检查或单一细胞DNA定量分析，差异有统计学意义（P<0.001）。两法联合诊断在特异度和阳性预测值较单一方法有所降低，假阳性率较单一方法稍高，但灵敏度、阴性预测值均高于单一方法，假阴性率低于单一方法。两法联合诊断结果为阴性时，其最终诊断恶性的风险降低为8.5%(12/141），低于单一细胞病理学检查或单一细胞DNA定量分析阴性的恶性风险。

图3良性浆膜腔积液DNA含量和细胞数量坐标图

图4良性浆膜腔积液DNA含量和细胞核面积坐标图

表2细胞病理学检查、细胞DNA定量分析及两法联合诊断价值

3、讨论

浆膜腔积液包括恶性（肿瘤性）积液和良性（非肿瘤性）积液。良性病变包括肺部感染、脑梗死、肝硬化、膈下感染、Meigs综合征、胰腺炎、充血性心力衰竭、肾病及免疫抑制剂引起的感染等。恶性积液由原发性及转移性肿瘤引起，如肺、乳腺、胃肠道、卵巢肿瘤、淋巴瘤及间皮瘤等，其中转移性腺癌是引起恶性积液最常见的原因。细胞病理学技术通过观察细胞形态及制备细胞块行免疫组化染色，对恶性积液的诊断价值值得肯定，但其不足之处是对恶性肿瘤细胞的检出灵敏度较低[1]，导致很多恶性积液被漏诊[8]。众所周知，DNA是细胞生长、分化和繁殖的基础，也是遗传的物质基础。致癌因素引起的基因突变、丢失、异常扩增或染色体移位、融合等被认为是肿瘤发生的早期分子事件，并导致细胞核的大小、核内DNA含量及DNA在细胞核内的分布和排列形式等改变。准确测定细胞DNA含量的微小异常变化，发现异常细胞，成为使用全自动细胞DNA定量分析技术进行肿瘤早期诊断的理论基础[9]。此外，细胞内DNA含量变化可以直接反映细胞增殖的能力，恶性浆膜腔积液中的肿瘤细胞具有无限增殖能力，其细胞DNA含量明显增加，测定细胞DNA含量可以作为判断恶性胸腔积液及腹水的客观依据[10]。细胞DNA含量通常用DNA指数（DI）或C来表示，健康人体细胞多为二倍体（即2C）细胞，DNA含量恒定。正常细胞增殖周期DNA含量的改变在2C～4C之间，而肿瘤细胞DNA含量常≥5C。当异倍体细胞DNA含量在2C～4C形成峰时，或者是当有3个DNA含量为≥5C的细胞时，那么就可以诊断为恶性[10]。由于细胞在癌变早期即可发生DNA含量的改变，因此理论上全自动细胞DNA定量分析技术的诊断灵敏度会更高。

本研究结果显示，细胞病理学检查诊断恶性浆膜腔积液的灵敏度和特异度分别为72.3%和96.6%，与多数研究类似[1,5,11,12]。细胞病理学检查通过观察细胞形态及制备细胞块行免疫组化染色，对恶性浆膜腔积液的诊断特异度很高。本研究中细胞病理学检查的假阳性率仅3.4%,5例假阳性病例均为可疑肿瘤细胞组。免疫组化标志物还可以辅助判断恶性积液的肿瘤细胞来源，本研究中细胞病理学检查的65例阳性病例中有35例（53.8%）经过免疫组化染色明确了原发部位。但不足之处为，细胞病理学检查的灵敏度不高，假阴性率较高，造成较高比例的肿瘤漏诊。细胞DNA定量分析作为一项新兴技术，可以在一定程度上弥补细胞病理学检查的不足。

有文献报道，细胞DNA定量分析在不同恶性组织的灵敏度为70.0%～91.7%，特异度为54.1%～100.0%[12]。另外，有文献报道，浆膜腔积液的DNA定量分析灵敏度为57.1%～74.0%，特异度为79.2%～93.7%[5,6]。本研究利用细胞DNA定量分析恶性浆膜腔积液的灵敏度和特异度分别为73.5%和89.8%，与上述文献报道较一致。作为一种新型、客观的诊断技术，从全自动细胞DNA定量分析来判断浆膜腔积液的良恶性仍然存在一定的假阳性和假阴性[5]。本研究结果表明，其假阳性率和假阴性率分别为10.2%和26.5%。假阳性可能是与浆膜腔积液中存在大量的炎症细胞和多核细胞等有关；另外炎性反应也可能导致细胞发生不典型增生，使细胞产生异型；少数炎性积液细胞可出现细胞退变或核固缩，这些细胞DNA含量可能≥5C。假阴性的主要原因包括：（1）肿瘤细胞未脱落至浆膜腔；（2）对重叠或成团的肿瘤细胞不能识别，不能将重叠或成团的细胞分割开，而浆膜腔积液中转移的肿瘤细胞多为腺癌细胞，常聚集成团出现；（3）肿瘤早期先于DNA序列上的碱基对发生改变或小片段消失或增加，这阶段染色体对数没有发生改变，因此很难测定出此阶段的DNA改变；（4）某些肿瘤细胞DNA的丢失和复制平衡，导致肿瘤细胞净DNA正常；（5）与高分化的二倍体肿瘤有关，如某些白血病、鼻咽癌这类二倍体肿瘤，虽已到晚期，染色体对数始终没有发生改变，细胞DNA定量分析系统无法将这类肿瘤与正常二倍体细胞区别开来。

本研究结果显示，细胞DNA定量分析和细胞病理学检查各有其优势和局限性，前者灵敏度略高，后者特异度较高，但二者在诊断效能上（约登指数为0.633vs.0.689,ROC曲线下面积为0.832vs.0.853）差异无统计学意义（P=0.099）。单一细胞DNA定量分析或细胞病理学检查均可导致一部分恶性肿瘤患者的漏诊，阴性结果的恶性风险分别为14.3%和13.9%；而细胞病理学检查联合细胞DNA定量分析诊断阴性的最终恶性风险降低为8.5%，有效降低了恶性肿瘤的漏诊，提高了阳性检出率。两法联合诊断恶性浆膜腔积液的约登指数和ROC曲线下面积均高于单一细胞病理学检查（约登指数为0.733vs.0.689,ROC曲线下面积为0.892vs.0.853,P<0.001）或单一细胞DNA定量分析（约登指数为0.733vs.0.633,ROC曲线下面积为0.892vs.0.832,P<0.001），差异均有统计学意义。由此可见，两法联合使用判断浆膜腔积液的性质，诊断效能明显高于单一方法。

4、结论

总之，在判断浆膜腔积液的良恶性质方面，全自动细胞DNA定量分析技术是一种结果客观、操作简单，可重复性强，且具有一定临床价值的诊断技术。虽然全自动细胞DNA定量分析技术只能帮助识别细胞的良恶性，无法得到准确的病理类型，但该法联合细胞病理学检查可明显提高恶性浆膜腔积液的检出率，通过细胞块的免疫组化染色可以明确部分恶性肿瘤细胞的病理类型及组织来源，进而指导临床精准治疗。

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基金:北京市石景山区医学重点扶持专科建设项目(20170008);北京市石景山医院院级科研项目(SJSKY-201905).