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CARM1表达和食管癌细胞增殖和迁移相关性的研究

2020-11-16 406 上传者：管理员

摘要：为探讨共激活相关精氨酸甲基转移酶1(coactivator-associatedargininemethyltransferase1,CARM1)对食管癌细胞增殖和迁移能力的影响,采用免疫组织化学方法检测食管癌组织和癌旁组织中CARM1的表达情况,利用特异的短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)分别敲低食管癌细胞株KYSE510和TE-1中CARM1的表达,通过过表达质粒上调食管癌细胞株KYSE150和ECA9706中CARM1的表达,采用CCK-8生长曲线试验和平板克隆形成试验检测CARM1敲低和上调后的食管癌细胞增殖能力的变化情况,并采用Transwell细胞迁移试验检测细胞迁移能力的变化情况。结果显示,与癌旁组织比较,CARM1蛋白在食管癌组织中高表达(P<0.01);敲低CARM1后食管癌细胞的迁移和增殖能力减弱(P<0.05);过表达CARM1后食管癌细胞的迁移和增殖能力增强(P<0.05)。提示CARM1在促进食管癌细胞生长和恶性肿瘤进展过程中发挥重要作用。

关键词：
共激活相关精氨酸甲基转移酶1
增殖
癌细胞
迁移
食管癌
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蛋白质精氨酸甲基转移酶(proteinargininemethyltransferase,PRMT)属于一类在哺乳动物中常见的酶类家族,能催化多肽中的精氨酸氮原子发生甲基化。迄今为止已经发现有9个成员,它们有着广泛的生物学功能,涉及细胞信号转导、转录调控、mRNA剪接、DNA修复等过程[1,2]。PRMT4更为人所熟知的名称是共激活相关精氨酸甲基转移酶1(coactivator-associatedargininemethyltransferase1,CARM1),它最早是通过结合p160类固醇受体共激活剂而被人们所发现。CARM1参与转录、前mRNA剪接、细胞周期和DNA损伤反应等[3,4,5]。已有研究发现,CARM1在多种肿瘤中表达失调,包括结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、骨肉瘤等[6,7,8,9]。然而,CARM1在食管癌中的作用尚未见大量研究。

食管癌在我国属于高发的恶性肿瘤之一,五年生存率一直处于较低水平。本研究通过检测食管癌组织中CARM1的表达,并在细胞水平观察CARM1敲低对食管癌细胞增殖及迁移能力的影响,旨在为食管癌的临床治疗提供新的肿瘤标志物。

1、材料和方法

1.1 细胞培养

人食管癌细胞株KYSE510、TE-1、ECA9706均由上海交通大学医学院附属新华医院分子生物实验室保存,KYSE150购自中国科学院细胞库,培养于RPMI1640培养液中;人正常食管上皮细胞HET-1A由上海交通大学医学院附属新华医院分子生物实验室保存,培养于DMEM培养液中,添加10%的FCS(Gibco公司)以及100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。所有细胞均在含5%CO2的37℃恒温孵育箱中培养。

1.2 质粒转染

采用脂质体转染的方法,在使用转染试剂Lipofectamine3000转染前1d,将待转染的细胞按一定的密度接种于6孔板,培养24h后根据试剂说明书进行质粒转染。其中,干扰CARM1表达采用短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA),所用质粒名称为GV493,靶点序列为CACAACAACCTGATTCCTT;CARM1过表达所用质粒名称为GV146,克隆位点为XhoI/EcoRI,基因序列为NM_199141,长度为199141bp。

1.3 CCK-8生长曲线试验

在食管癌细胞质粒转染后24h将细胞消化下来,以3×103个/孔的密度将细胞接种于96孔板(100μL/孔),待细胞完全贴壁后加入10μLCCK-8试剂(Dojindo公司),37℃5%CO2培养1h后测定光密度[D(450nm)]。以24h为检测间隔,连续检测5d。

1.4 mRNA的检测分析

按照试剂盒说明书提取细胞RNA,用NanoDrop2000分光光度计检测RNA的浓度和纯度,按TaKaRa反转录试剂盒说明书将RNA合成cDNA,采用TaKaRa荧光定量PCR试剂盒进行CARM1基因检测,以GAPDH为内参。反应条件为:95℃预变性30s,95℃变性5s,60℃退火并延伸34s,共进行40个循环。采用2-△△Ct法分析结果。

1.5 Westernblotting

裂解细胞收集蛋白,对蛋白进行电泳,经SDS-PAGE凝胶分离后,4℃以300mA恒流湿法转膜90min,室温封闭1h,4℃一抗孵育过夜后用PBST洗3次(10min/次),之后室温避光孵育二抗1h,用PBST避光洗3次(10min/次)。用ODYSSEY红外成像系统扫描聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜。

1.6 Transwell细胞迁移试验

对胰蛋白酶消化转染后24h的细胞进行细胞计数,用含1%FCS的RPMI1640培养液制备细胞悬液,取500μL含1×105个细胞的细胞悬液接种于Transwell小室内,在24孔板的孔中加入含有10%FCS的RPMI1640培养液。37℃5%CO2培养48h,擦掉Transwell小室内未穿膜的细胞,用4%的多聚甲醛固定穿过膜的细胞,再用结晶紫染色液染色,在显微镜下观察、拍照,选取5个视野进行计数。

1.7 免疫组织化学染色

将组织芯片依次进行二甲苯脱蜡和乙醇梯度脱水(100%、80%、60%),将芯片放入0.1%枸橼酸溶液中煮沸15min进行抗原修复,使用山羊血清稀释液室温封闭20min,一抗孵育1～2h,PBS洗涤4次(10min/次),二抗孵育30min,PBS洗涤4次(10min/次),然后进行二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色和苏木精复染,乙醇梯度脱水,二甲苯透明,滴加中性树脂封片。

1.8 平板克隆形成试验

取生长状态良好的对数期细胞进行消化计数,以每孔7000个细胞接种于6孔板中。在细胞培养箱中持续培养2～3周后取出培养液,用PBS洗涤3次,使用4%的多聚甲醛固定液固定细胞10min,去除固定液,用PBS清洗3次,用结晶紫溶液染色30min,PBS洗涤后风干,拍照并记录,计算所形成的细胞克隆数。

1.9 统计学处理

所有数据采用SPSS17.0软件进行统计分析,计量资料以x¯±sx¯±s表示,两组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 CARM1在食管癌组织中的表达

对含有87例食管癌患者的癌组织和癌旁组织的蛋白组织芯片(该芯片购于上海芯超生物技术有限公司,附带生存期数据)进行免疫组织化学分析,发现CARM1在食管癌组织中的表达水平较癌旁组织显著升高(P<0.01),且CARM1的表达水平越高,患者生存期越短。此外,CARM1的表达水平随着肿瘤的进展呈现升高的趋势。(图1)

2.2 CARM1在食管癌细胞中的表达

在食管癌细胞中,用RT-PCR和Westernblotting从mRNA和蛋白水平分析了CARM1的表达水平。结果显示,食管癌细胞CARM1的表达水平较正常食管上皮细胞显著升高(P<0.05)。(图2)

2.3 敲低CARM1对食管癌细胞体外迁移能力的影响

为了更深入地研究CARM1在食管癌细胞中的作用,本研究对2株CARM1表达相对较高的食管癌细胞株(KYSE510和TE-1)进行shRNA转染。Westernblotting结果显示,转染shRNA后,与阴性对照(shorthairpin-negativecontrol,sh-NC)组比较,敲低的CARM1(shorthairpin-CARM1,sh-CARM1)组KYSE510和TE-1细胞的CARM1蛋白表达水平明显下降,表明shRNA对CARM1具有良好的敲低效果。利用Transwell细胞迁移试验检测敲低CARM1后食管癌细胞迁移能力的变化。结果显示,敲低CARM1后食管癌细胞的迁移能力显著减弱(P<0.01)。(图3)

2.4 敲低CARM1对食管癌细胞体外增殖能力的影响

通过平板克隆形成试验、CCK-8生长曲线试验检测敲低CARM1对食管癌细胞增殖能力的影响。结果显示,与sh-NC组比较,敲低CARM1后食管癌细胞的增殖能力明显减弱(P<0.05)。(图4、图5)

图1CARM1在食管癌中的表达及与患者生存期及肿瘤分期的关系

图2食管癌细胞及正常食管上皮细胞中CARM1的表达

图3敲低CARM1后食管癌细胞株KYSE510和TE-1CARM1蛋白的表达及其对细胞迁移能力的影响

图4平板克隆形成试验检测敲低CARM1对食管癌细胞体外增殖能力的影响

图5CCK-8生长曲线试验检测敲低CARM1对食管癌细胞体外增殖能力的影响

2.5 过表达CARM1对食管癌细胞迁移能力的影响

为进一步验证CARM1对食管癌细胞的作用,本研究选取了另外2株CARM1表达相对较低的食管癌细胞株ECA9706、KYSE150进行CARM1过表达质粒的转染。Westernblotting结果显示,与阴性对照(negativecontrol,NC)组比较,转染过表达质粒后,过表达组ECA9706和KYSE150细胞中CARM1蛋白表达水平明显增强,证明本研究的过表达质粒转染是有效的。同样通过Transwell细胞迁移试验检测过表达CARM1对食管癌细胞迁移能力的影响。结果显示,与NC组比较,过表达CARM1后食管癌细胞的迁移能力明显增强(P<0.05)。(图6)

图6过表达CARM1对食管癌细胞迁移能力的影响

2.6 过表达CARM1对食管癌细胞增殖能力的影响

CCK-8生长曲线试验结果显示,与NC组比较,CARM1过表达组的细胞增殖能力明显增强(P<0.05)。平板克隆形成试验结果显示,CARM1过表达组食管癌细胞形成的细胞克隆数较NC组显著增多(P<0.05)。进一步验证了CARM1可促进食管癌细胞的增殖。(图7)

图7过表达CARM1对食管癌细胞增殖能力的影响

3、讨论

在我国,食管癌的发病率居第6位,死亡率居第4位[10],发病类型主要是食管鳞状细胞癌。虽然随着医疗技术的提高,我国食管癌的五年生存率有了一定的提高,但仍处在10%～30%的较低水平[11]。其主要原因是肿瘤的转移与复发,因此,阐明肿瘤迁移与增殖的分子生物学机制尤为重要。

CARM1属于Ⅰ型PRMT,其涉及细胞自噬、mRNA剪接、DNA修复和表观遗传调控。已有研究发现,CARM1在许多恶性肿瘤中过表达,且能反式激活许多恶性肿瘤相关转录因子,如p53[12]、E2F相关转录因子1(E2Ftranscriptionfactor1,E2F1)[13]、雄激素受体[14]和雌激素受体α[9]。有研究发现,CARM1在骨肉瘤中过表达,且可通过磷酸化糖原合成酶激酶3β/β-连环蛋白/细胞周期蛋白D1信号通路促进人骨肉瘤细胞的增殖[8]。Frietze等[13]发现,CARM1通过上调E2F1促进雌激素刺激的乳腺癌细胞的生长。然而,CARM1与食管癌的关系尚未明确。

本研究首先通过免疫组织化学分析对食管癌组织芯片的CARM1表达水平进行检测,发现食管癌组织中CARM1蛋白的表达水平较癌旁组织显著升高,并且在食管癌细胞中CARM1mRNA和蛋白水平较人正常食管上皮细胞明显升高。为了进一步探讨CARM1对食管癌细胞生物学功能的影响,本研究进行了一系列的体外试验。利用shRNA对食管癌细胞中的CARM1表达水平进行敲低,发现敲低CARM1后的细胞与sh-NC组相比其迁移能力以及增殖能力均明显减弱。因而本研究又对食管癌细胞中的CARM1进行过表达来进一步验证CARM1的作用。结果表明,过表达后食管癌细胞的迁移和增殖能力显著增强。由此可以证明,CARM1在食管癌细胞中扮演着癌基因的角色。但CARM1是通过怎样的机制影响细胞的增殖和迁移能力,又是通过怎样的信号通路发挥作用的呢?我们将对这些问题进行进一步研究。

任懿倩,郑英霞,戎伟芳.CARM1表达与食管癌细胞增殖和迁移相关性的研究[J].现代免疫学,2020,40(05):353-359.