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Rab31对神经胶质瘤细胞增殖迁移侵袭的影响及机制研究

2021-03-05 547 上传者：管理员

摘要：目的:研究Rab31对人神经胶质瘤细胞增殖迁移侵袭的影响及相关分子机制。方法:Westernblot检测正常人胶质细胞NHA和3株人神经胶质瘤细胞SHG-44、TJ905和LN229中Rab31表达;将3种Rab31沉默siRNA及其对照分别转染至神经胶质瘤SHG-44细胞中,分别记为si-Rab31-1组、si-Rab31-2组、si-Rab31-3组和si-NC组,Westernblot验证转染效率,CCK-8法检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞迁移侵袭,Westernblot检测PI3K/AKT信号通路蛋白PI3Kp101、p-AKT和AKT表达水平。结果:与正常人胶质细胞NHA相比,神经胶质瘤细胞SHG-44、TJ905和LN229中Rab31蛋白表达显著增加(P<0.01);与si-NC组比较,si-Rab31-1、si-Rab31-2和si-Rab31-3组神经胶质瘤细胞SHG-44中Rab31蛋白表达显著降低(P<0.01),其中si-Rab31-2组SHG-44细胞中Rab31表达最低;抑制Rab31表达可显著抑制SHG-44细胞增殖、迁移和侵袭,并抑制SHG-44细胞中PI3K/AKT信号通路转导(P<0.01)。结论:抑制Rab31可通过抑制PI3K/AKT信号通路转导抑制胶质瘤SHG-44细胞增殖、迁移和侵袭。

关键词：
Rab31
侵袭
增殖
神经胶质瘤
迁移
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在人类癌症中,神经胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤之一,其具有很高的发病率和死亡率[1]。神经胶质瘤的疗效主要取决于肿瘤的分子特征[2],因此,寻找更多的分子靶点来治疗胶质瘤至关重要。脑中Ras相关的蛋白质31(Ras-relatedproteininbrain31,Rab31)也被称为Rab22b,是Rab家族的成员,该家族属于小GTP酶Ras超家族,也被称为Rab5亚家族[3]。与Rab家族的其他成员一样,Rab31在整个细胞中表达,主要起调节囊泡膜转运的作用[4]。最初发现Rab31参与许多物质的运输,例如4型葡萄糖转运蛋白、表皮生长因子受体和6-磷酸甘露糖受体[3]。最近,还发现它在乳腺癌、胶质母细胞瘤和肝细胞癌等人类癌症中起着重要作用[5,6]。在乳腺癌中,Rab31首先被确定为独立的预后因素,随后被发现与粘蛋白1C末端亚基癌蛋白相互作用,从而促进患者的癌症进展和随后的他莫昔芬耐药性[7,8,9,10]。但是,Rab31在神经胶质瘤中的功能仍未完全阐明。本研究将检测Rab31在神经胶质瘤细胞中的表达,并以胶质瘤SHG-44细胞为研究对象,探讨Rab31对SHG-44细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并分析其作用机制。

1、材料和方法

1.1主要材料

正常人胶质细胞NHA和神经胶质瘤细胞SHG-44、TJ905和LN229购自美国ATCC公司;DMEM培养液、胎牛血清、青-链霉素、胰酶、磷酸盐缓冲液(phosphate-bufferedsaline,PBS)购自美国Hyclone公司;3种Rab31沉默siRNA和对照siRNA购自上海吉玛制药有限公司;放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitationassay,RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid,BCA)蛋白定量试剂盒、细胞计数试剂盒-8(cellcountingkit-8,CCK-8)购自上海碧云天生物技术有限公司;Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司;Transwell小室购自美国Corning公司;Rab31、PI3Kp101、p-AKT、AKT和GAPDH抗体购自美国abcam公司;聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜、增强化学发光(enhancedchemiluminescence,ECL)试剂盒购自德国MerckMillipore公司。

1.2细胞培养

采用含10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM培养基培养细胞,放置于37℃、5%CO2细胞培养箱中进行培养,待细胞培养至80%融合度时用胰酶进行消化,收集对数生长期细胞进行后续实验。

1.3细胞转染和分组

取对数生长期SHG-44细胞接种至6孔板中,每孔接种2×105个,添加培养基至2mL,培养基中不添加抗生素。待细胞长至80%融合度时,按照Lipofectamine2000说明书,分别将3种Rab31沉默siRNA和对照siRNA转染至SHG-44细胞中,分别记为si-Rab31-1组、si-Rab31-2组、si-Rab31-3组和si-NC组。

1.4细胞增殖测定

取对数生长期SHG-44细胞接种至96孔板中,每孔4000个细胞并添加培养液至100μL,以此刻记为0h,分别于培养24、48、72h时,每孔加入10μLCCK-8溶液,孵育4h后弃去培养液,每孔加入150μL二甲基亚砜,应用酶标仪测定450nm波长处各孔光吸收值。

1.5细胞迁移侵袭检测

取预铺基质胶和无预铺基质胶的Transwell小室置于24孔板中,其中预铺基质胶的小室每孔加入50μL无血清培养基润化30min,无预铺基质胶的小室不做任何处理。取1×105个对数生长期的si-NC组、si-Rab31-2组细胞接种至Transwell小室中,并添加无血清培养基至200μL,下室中加600μL完全培养基,每组设置3个复孔。培养48h后,PBS洗涤2次,100%甲醇固定10min,晾干,0.1%结晶紫染色10min,去离子水洗去残留染液,显微镜下观察并拍照,计数各组迁移侵袭细胞数。

1.6Westernblot检测

应用RIPA蛋白裂解液提取细胞总蛋白,BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度,SDS-PAGE电泳分离蛋白样品,后转至PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭2h,分别用Rab31、PI3Kp101、p-AKT、AKT和GAPDH一抗稀释液于4℃孵育过夜,回收一抗稀释液,用添加吐温-20的Tris-缓冲盐(Tris-BufferedSalineTween-20,TBST)洗涤3次,每次10min,加入适量相应的辣根过氧化物酶偶联二抗,室温孵育2h,经TBST洗涤3次后用增强化学发光法于化学发光成像系统中进行曝光显影,以GAPDH为内参,ImageJ软件分析各个蛋白相对表达水平。

1.7统计学分析

实验数据以均数±标准差(x¯±s)表示,采用SPSS21.0统计学软件对数据进行统计学分析,两组间采用独立样本t检验,多组间采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1神经胶质瘤细胞中Rab31高表达

结果如图1所示,与正常人胶质细胞NHA相比,神经胶质瘤细胞SHG-44、TJ905和LN229中Rab31蛋白表达显著增加(P<0.01),其中SHG-44细胞中Rab31表达相对较高,故选择SHG-44细胞进行后续实验研究。

图1神经胶质瘤细胞系中Rab31蛋白表达

2.2构建抑制Rab31表达的SHG-44细胞株

结果如图2所示,与si-NC组比较,si-Rab31-1、si-Rab31-2和si-Rab31-3组神经胶质瘤细胞SHG-44中Rab31蛋白表达显著降低(P<0.01),其中si-Rab31-2组SHG-44细胞中Rab31表达最低,故利用si-Rab31-2转染来抑制SHG-44细胞中Rab31的表达。

2.3抑制Rab31对细胞增殖的影响

与si-NC组比较,72h时si-Rab31-2组神经胶质瘤细胞SHG-44的相对吸光度值显著降低(P<0.01),表明抑制Rab31表达可显著抑制SHG-44细胞增殖(图3)。

图2各组SHG-44细胞中Rab31蛋白表达

图3抑制Rab31后SHG-44细胞相对吸光度值

2.4抑制Rab31对细胞迁移侵袭的影响

与si-NC组比较,si-Rab31-2组神经胶质瘤SHG-44细胞迁移和侵袭细胞数均显著降低(P<0.01),表明抑制Rab31表达可显著抑制SHG-44细胞迁移和侵袭能力(图4)。

图4抑制Rab31后SHG-44细胞迁移侵袭细胞数

2.5抑制Rab31对细胞中PI3K/AKT信号通路的影响

与si-NC组比较,si-Rab31-2组神经胶质瘤SHG-44细胞中PI3K/AKT信号通路蛋白PI3Kp101和p-AKT表达显著降低(P<0.01),总的AKT表达无明显变化,表明抑制Rab31表达可显著抑制SHG-44细胞中PI3K/AKT信号通路转导(图5)。

3、讨论

神经胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤,占恶性脑肿瘤的81%,其预后不良,极具侵略性[11,12]。影像学是诊断胶质瘤的有效方法[13],而分子疗法仍是胶质瘤的主要治疗方法[2],因此本研究将重点探讨神经胶质瘤肿瘤发生的新型分子机制。

图5抑制Rab31后SHG-44细胞中PI3K/AKT信号通路蛋白表达

Rab蛋白构成了最大的单体小GTP酶家族,并在人类基因组内有超过60个编码基因,这些基因控制真核细胞中的膜转运过程。RabGTP酶是膜运输的关键调节剂,并介导许多生物过程,其中调节失调可能导致疾病发生[14,15,16,17]。Rab蛋白的异常表达被发现会导致神经系统疾病和神经退行性疾病,脂质贮积障碍和癌症[6]。越来越多的证据表明,Rab家族的几个成员参与了各种癌症的发展。已有研究发现,Rab25可促进肾细胞癌和头颈部鳞状细胞癌的增殖、迁移和侵袭[18,19];Rab24参与人上皮性卵巢癌顺铂耐药性[20];Rab8a在子宫内膜癌中表达异常增加[21]。ZHANG的研究小组发现,Rab1是mTORC1激活剂,并负责大肠癌中由高活性氨基酸信号驱动的肿瘤发生[22]。Rab27a在胰腺导管腺癌组织中表达上调,并与病人较差的预后有关[23]。另外,一些Rab蛋白被认为具有抑癌作用,如TSAI的研究小组在肺癌转移患者中发现Rab37表达下调,并与病人转归较差有关,进一步研究表明,Rab37可促进TIMP-1进行胞吐作用,进而抑制肿瘤转移[24];OKON和他的同事发现,Rab7通过调节肺腺癌中Neuropilin-1的降解来抑制血管生成[25]。上述研究表明不同Rab蛋白在肿瘤中发挥不同作用。

Rab31是Rab家族成员之一,多项研究表明其在乳腺癌、肝细胞癌和卵巢癌等肿瘤中可促进细胞增殖并抑制细胞凋亡[5]。本研究发现了Rab31促进神经胶质瘤发生发展的新机制。本研究通过Westernblot分析发现神经胶质瘤细胞中Rab31表达上调,且抑制Rab31表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭,上述结果强烈表明,Rab31在神经胶质瘤中起着重要的作用。PI3K及其下游信号通路在人类肿瘤中起着重要的致癌作用,PI3K抑制剂如idelalisib、BKM120和copanlisib等现已作为抗癌药物进行临床试验[26,27,28]。本研究发现,抑制Rab31可显著抑制PI3K/AKT信号通路蛋白PI3Kp101和p-AKT的表达,抑制PI3K/AKT信号通路转导。

综上所述,Rab31在神经胶质瘤细胞中高表达,抑制其表达能够显著降低人神经胶质瘤SHG-44细胞的增殖、迁移和侵袭能力,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关,提示Rab31有望成为诊断和治疗神经胶质瘤的新的生物标志物。

参考文献：

[4]黄薇,康雁君.Rab蛋白在膜转运中的角色及相关细胞生物功能[J].生命的化学,2016,36(1):27-32.

杜嘉瑞,苏作鹏,吴少帅,徐福林,沈刚.Rab31对神经胶质瘤细胞增殖迁移侵袭的影响及机制研究[J].现代肿瘤医学,2021,29(08):1306-1310.

基金:上海闵行区自然科学研究课题(编号:2019MHZ102)