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结直肠癌组织中miR-621的表达及对细胞活性、细胞增殖和迁移侵袭的影响分析

2020-08-10 285 上传者：管理员

摘要：目的探讨miR-621在结直肠癌组织中的表达及对细胞活性、细胞增殖和迁移侵袭的影响。方法选择20对结直肠癌患者的癌组织及其相应癌旁正常组织(距癌组织边缘>5 mm)，采用qRT-PCR法检测miR-621在人结直肠癌组织和癌旁正常组织中的表达。合成可抑制miR-621表达的甲氧基修饰的反义寡核苷酸链ASO-miR-621后，取对数生长期的结直肠癌细胞HCT116和SW480，分为NC组、miR-621组、ASO-NC组、ASO-miR-621组，分别转染pc DNA3、pc DNA3-miR-621、ASO-NC及ASO-miR-621，采用MTT法、细胞集落形成实验及Transwell迁移侵袭实验研究miR-621在结直肠癌细胞中的作用。结果 miR-621在结直肠癌组织中表达低于其相应癌旁正常组织(P<0. 05); miR-621组细胞生长活性、增殖和迁移侵袭能力低于NC组(P均<0. 05),ASO-miR-621组细胞生长活性、增殖和迁移侵袭能力高于ASO-NC组(P均<0. 05)。结论 miR-621在结直肠癌组织中呈低表达; miR-621可抑制结直肠癌细胞的活性、增殖和迁移侵袭，起到抑癌基因的作用。

关键词：
侵袭
微小RNA
恶性肿瘤
结直肠癌
迁移
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结直肠癌在世界范围内是一类多发的恶性肿瘤，其临床发病率居恶性肿瘤第三位，临床致死率在所有肿瘤中位居第三[1]。据统计，全世界每年被诊断出患结直肠癌的病例多达百万，超过1/2的患者死亡[2]。由于结直肠癌难以及时发现，往往一经诊断即为晚期，预后极差。近年研究发现，微小RNA(miRNA)在肿瘤发生发展中发挥复杂和多样性的作用[3,4]。miRNA是一种长度约22 nt的非编码RNA，能结合在其相应靶基因的3'-UTR区域，进而通过调控靶基因的表达参与肿瘤的发生发展[5,6]。研究表明，miR-621通过下调CAPRIN1表达在肝癌进展中充当肿瘤抑制基因，并且可能是肝癌新的潜在诊断和预后生物标志物[7]。另外，miR-621通过抑制FBXO11和增强p53活性抑制来增强乳腺癌细胞对PTX/CBP化学疗法的化学敏感性[8]。然而，在结直肠癌中miR-621的功能仍不清楚。本研究中，我们检测了miR-621在结直肠癌组织中的表达，并研究其对细胞活性、细胞增殖和迁移侵袭的影响。

1、材料与方法

1.1材料

组织样本与细胞株:20对结直肠癌患者的癌组织及其相应癌旁正常组织(距癌组织边缘>5 mm)来源于2015年11月天津医科大学第二医院普通外科，所有的组织样本均来自于未经过放化疗的结直肠癌患者手术切除，且经过术后病理学证实。本研究经过天津医科大学第二医院伦理委员会同意进行。结直肠癌细胞系HCT116和SW480为本实验室所保存，培养基为DMEM(GIBCO BRL公司，美国):含10%胎牛血清和1%双抗(100μg/m L青霉素和100μg/m L链霉素)。细胞培养在含5%CO2的细胞培养孵箱中进行，温度为37℃。主要试剂:DMEM培养基、无血清培养基Opti-MEMα、胰蛋白酶和胎牛血清购自美国GIBCO BRL公司;Lipofectamine2000脂质体购自美国Invitrogen公司;SYBR Premix Ex Taq试剂盒购自日本TaKaRa公司，引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成;Transwell小室购自美国Corning Incorporated公司，Matrigel胶来自美国BD公司;实验所用抗体全部购自中国天津赛尔生物技术有限公司。

1.2 miR-621表达检测

采用qRT-PCR法。使用TRIzol裂解液提取结直肠癌组织与结直肠癌细胞中的总RNA。提取后的总RNA用逆转录法制备RT产物得到相应c DNA。其中，miR-621的逆转录法制备RT产物所需要的RT引物为5'-GTCGTATC-CAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAGG-TAAGC-3';制备内参U6的RT产物所用的RT引物为:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG-CACTGGATACGACAAAATATGGAAC-3'。使用BioRad i Q5实时荧光定量PCR仪检测miR-621、U6的RNA水平。反应体系为15μL:2×SYBR Premix Ex Taq 7.5μL;PCR正向引物(5 pmol/μL)1μL;PCR反向引物(5 pmol/μL)1μL;RT产物cDNA 1μL;RNA酶free H2O 4.5μL。扩增条件:95℃预变性4min;95℃30 s,56℃30 s,72℃30 s,40个循环。miR-621与U6 RNA的扩增引物序列:miR-621正向引物:5'-TGCGGGGCTAGCAACAGCGCTT-3'，反向引物:5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3';U6正向引物:5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3'，反向引物:5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。数据计算采用2-ΔΔCt法。

1.3质粒构建

pc DNA3/pri-miR-621质粒构建:以HCT116的基因组DNA为模板，PCR扩增pri-miR-621的DNA片段。扩增正向引物:5'-CGCGGATC-CTCCCCAAGATGCTCTACTCTT-3';反向引物:5'-CCT-GAATTCAGCCACTGCGCCTGGCCTACA-3'。扩增后的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后进行回收，并且经Bam HⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点酶切，连接至经相同酶切位点酶切后的空载体pc DNA3上。

1.4细胞转染

使用Lipofectamine2000对相应结直肠癌细胞HCT116和SW480进行转染。具体方法按照说明书操作。

1.5 miR-621干预后结直肠癌细胞活性检测

采用MTT实验。取对数生长期的结直肠癌细胞HCT116和SW480，分为NC组、miR-621组、ASO-NC组、ASO-miR-621组，种板后第2天对细胞分别转染pcDNA3、pcDNA3-miR-621、ASO-NC及ASO-miR-621，转染24 h后分别取3 000/孔(HCT116细胞系)、5 000/孔(SW480细胞系)种于96孔细胞培养板中(设置5个复孔)，放入细胞培养箱中继续培养，在24、48和96 h三个时间点分别对孔内细胞用DMSO和MTT进行处理，之后检测570 nm波长处的吸光度值。细胞活性=对照组吸光度值-实验组吸光度值/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%。

1.6细胞克隆形成率测算

采用平板克隆形成实验。取对数生长期的结直肠癌细胞HCT116和SW480，分为NC组、miR-621组、ASO-NC组、ASO-miR-621组，种板后第2天对细胞分别转染pcD-NA3、pcDNA3-miR-621、ASO-NC及ASO-miR-621，转染24 h后分别取300/孔(HCT116细胞系)、500/孔(SW480细胞系)种在6孔细胞培养板中(设置复孔)，每3～5 d更换一次细胞培养板中的培养基，并在显微镜下持续观察孔板内细胞生长状况，待细胞数量达到≥50的集落形成标准后，从细胞培养孵箱中取出细胞培养板，用2%的结晶紫溶液对孔内细胞染色，拍照记录每孔细胞克隆数，平行孔取均值。

1.7细胞迁移侵袭能力检测

采用Transwell迁移侵袭实验。取对数生长期的结直肠癌细胞HCT116和SW480，分为NC组、miR-621组、ASO-NC组、ASO-miR-621组，种板后第2天对细胞分别转染pcDNA3、pcDNA3-miR-621、ASO-NC及ASO-miR-621，转染24 h后分别取3×104个/孔(HCT116细胞系)、5×104个/孔(SW480细胞系)和200μL无血清DMEM培养基混匀后接种在已放入24孔板内的Transwell小室中，24孔板内加入700μL含10%血清的DMEM培养基。侵袭实验在迁移实验基础上将Matrigel胶融化后与不含血清的DMEM培养基以1∶4混合后加入在Transwell小室的上层面后，再放入细胞培养孵箱中4 h，使其凝固后继续细胞迁移实验的操作。接种完毕后将细胞培养板放入培养箱中分别继续培养约24、48 h后，取出小室后擦净内侧细胞，再使用固定液(甲醇与冰乙酸的比例为3∶1)将小室外侧细胞固定，利用结晶紫对小室外细胞进行染色并用显微镜拍照记录后。

1.8统计学方法

采用GraphPad Prism6.0统计软件。计量数据以表示，两组间比较采用独立样本t检验，三组及以上间的比较应用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 miR-621在结直肠癌及癌旁正常组织中的表达比较

miR-621在结直肠癌、癌旁正常组织中的相对表达量分别为0.49±0.03、1.03±0.05,miR-621在结直肠癌组织中表达低于癌旁正常组织(P<0.01)。

2.2 miR-621对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

过表达miR-621可抑制细胞活性，封闭内源性miR-621后可促进结直肠癌细胞的活性(表1)。对于HCT116细胞，NC组、miR-621组、ASO-NC组、ASO-miR-621组结直肠癌细胞克隆形成率分别为(32.33±4.12)%、(11.67±2.32)%、(29.12±3.54)%、(72.33±7.24)%;对于SW480细胞，NC组、miR-621组、ASO-NC组、ASO-miR-621组结直肠癌细胞克隆形成率分别为(18.00±2.48)%、(6.14±0.98)%、(19.67±3.09)%、(49.02±6.28)%。对于HCT116细胞，NC组、miR-621组、ASO-NC组、ASO-miR-621组结直肠癌细胞迁移数量分别为(187±11)、(129±8)、(169±11)、(412±32)个，对于SW480细胞，NC组、miR-621组、ASO-NC组、ASO-miR-621组结直肠癌细胞迁移数量分别为(108±7)、(65±3)、(116±6)、(268±30)个，对于HCT116细胞，NC组、miR-621组、ASO-NC组、ASO-miR-621组结直肠癌细胞侵袭数量分别为(128±7)、(61±6)、(118±7)、(187±28)个，对于SW480细胞，NC组、miR-621组、ASO-NC组、ASO-miR-621组结直肠癌细胞侵袭数量分别为(105±10)、(58±5)、(118±6)、(170±19)个，miR-621组细胞生长活性、增殖和迁移侵袭能力低于NC组(P均<0.05),ASO-miR-621组细胞生长活性、增殖和迁移侵袭能力高于ASO-NC组(P均<0.05)。

表1各组结直肠癌细胞活性比较

3、讨论

近年来，在肿瘤组织中发现较多的miRNA异常表达，多数异常表达的miRNA在肿瘤发生发展中发挥重要作用[9,10,11]。最近报道显示，miR-621在肝癌组织和细胞中低表达，且在肝癌中充当抑癌基因角色[7,12]。另外，还有报道称miR-621在乳腺癌细胞中可通过抑制FBXO11表达提高p53的活性[8]。然而关于miR-621在结直肠癌中的作用仍未报道。因此，我们选取了miR-621作为结直肠癌细胞的实验研究对象，我们猜测miR-621可能通过某种方式使结直肠癌细胞的生物功能得到了抑制，从而通过实验研究miR-621在结直肠癌中的功能。首先，我们用qRT-PCR法检测了miR-621在结直肠癌细胞中的表达情况，结果表明，相比于癌旁正常组织，miR-621在结直肠癌中的表达较低。而过表达miR-621是否可抑制结直肠癌细胞的一些生物功能有待探究。我们猜想miR-621可能通过一些生物机制抑制结直肠癌细胞的发生发展。因此我们通过MTT、细胞平板克隆形成实验及Transwell迁移侵袭实验探究miR-621对结直肠癌细胞恶性表型的影响。实验结果显示，miR-621可抑制结直肠癌的细胞活性、增殖能力及迁移侵袭能力，表明miR-621在结直肠癌中发挥了抑癌基因的作用。

综上所述，miR-621在结直肠癌组织中呈低表达;miR-621可抑制结直肠癌细胞的活性、增殖和迁移侵袭，起到抑癌基因的作用。

曹权,刘为营,石立莹,甘建琛,刘民,朱云娟,汤华.miR-621在结直肠癌组织中表达及对细胞活性､细胞增殖和迁移侵袭的影响[J].山东医药,2020,60(19):39-42.