膀胱癌是发生于泌尿系统的常见恶性肿瘤，受遗传、环境、饮食、基因等多种因素的影响。目前，膀胱癌的治疗仍以手术切除和放化疗为主。由于膀胱癌细胞具有生物侵袭性和特异性放化疗耐药性，治疗后易转移和复发[1-2]。因此，寻找新的治疗方案和开发新型药物来改善膀胱癌患者的治疗效果意义重大。罗哌卡因为临床麻醉药，研究发现其也参与肿瘤的发生、发展[3]。ZHANG等[4]报道罗哌卡因通过抑制胰岛素样生长因子1受体/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(IGF-1R/PI3K/AKT/mTOR)信号通路活性抑制肝癌细胞的恶性生物学行为。QIAO等[5]报道罗哌卡因可抑制膀胱癌细胞增殖、诱导其自噬和凋亡，但罗哌卡因对人膀胱癌细胞的作用机制尚不十分清楚。c-Jun氨基末端激酶(JNK)在细胞增殖、转移、上皮间质转化(EMT)等生物过程中起着至关重要的调控作用[6]。ZHU等[7]研究发现重组人半乳糖凝集素1(Galectin-1)通过激活丝裂原活化蛋白激酶/JNK/应激激活的蛋白激酶p38信号通路诱导人卵巢癌细胞的转移及EMT进程。夏夏等[8]报道罗哌卡因可通过抑制JNK信号通路活性对细胞生长、迁移与侵袭起抑制作用。罗哌卡因通过JNK信号通路是否能对人膀胱癌J82细胞的生物学行为产生影响目前尚不清楚。基于此，本研究探讨罗哌卡因通过JNK信号通路对人膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭以及EMT的影响，以期为膀胱癌的治疗提供新的方向。

1、材料与方法

1.1材料

人膀胱癌J82细胞株购自通派(上海)生物科技有限公司。

1.2仪器与试剂

主要仪器包括二氧化碳培养箱(上海慕斯实验设备有限公司，型号160L)、倒置荧光显微镜(上海豫光仪器有限公司，型号：WMF-3690)、凝胶成像系统(广州科适特科学仪器有限公司，型号：GD-1000)。主要药品与试剂包括紫杉醇、罗哌卡因(上海致备生物有限公司)、JNK通路抑制剂SP600125、JNK通路激活剂茴香霉素(上海源叶生物有限公司)、细胞计数试剂盒-8(CCK-8,上海致备生物有限公司)、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)细胞增殖检测试剂盒(北京索莱宝生物有限公司)、鼠抗人一抗[包括波形蛋白(Vimentin)、纤维粘连蛋白(FN)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、JNK、磷酸化(p)-JNK、β-actin]、山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG,辣根过氧化物酶标记二抗，美国CST公司)。

1.3方法

1.3.1人膀胱癌J82细胞培养

人膀胱癌J82细胞接种于DMEM培养液[含10%胎牛血清(FBS)]中培养(37℃,5%CO2),70%～80%湿度培养箱中培养，换液间隔天数：2～3 d。传代(密度达80%)后用于研究(对数期细胞)。

1.3.2分组及给药

本研究分为预实验和正式实验。预实验分组包括对照组和低、中、高浓度罗哌卡因组。对照组不进行干预，低、中、高浓度罗哌卡因组依次加入200、400、800μmol/L罗哌卡因，干预24 h。设置空白组(只添加培养液)。根据预实验结果选择有显著作用浓度的罗哌卡因进行正式实验。正式实验：对照组、罗哌卡因组、阳性药物组、抑制剂组和激活剂组；对照组不进行干预，罗哌卡因组根据预实验结果添加有显著作用浓度的罗哌卡因，阳性药物组加入100 nmol/L紫杉醇[9],抑制剂组在罗哌卡因基础上加入20μmol/L JNK信号通路抑制剂SP600125[10],激活剂组在罗哌卡因基础上加1μg/mL JNK信号通路激活剂茴香霉素[11],干预24 h。每组设3次重复，置于培养箱中，37℃,5%CO2条件下培养24 h后进行各项指标测定。

1.3.3 J82细胞活力

取培养24 h的细胞，参照CCK-8试剂盒说明书进行操作，反应完成后，检测各孔吸光度(A)值(450 nm处),计算细胞活力。细胞活力(%)=(低、中、高浓度罗哌卡因组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%。

1.3.4 J82细胞增殖率

取培养24 h的细胞，具体步骤参照EdU细胞增殖检测试剂盒说明书操作处理，处理完成后装片，拍照(荧光显微镜),处理图片(Image-J 1.8.0软件)。红色细胞占蓝色细胞的百分比即为增殖率。

1.3.5 J82细胞侵袭数

将基质胶稀释为1 mg/mL,吸取80μL加入小室中，置37℃,5%CO2条件下培养5 h,将细胞悬液(200μL)加至Transwell上室，在下室中加入培养液(含10% FBS)600μL,并进行24 h培养后弃上清液。将小室表面的细胞擦去，清洗3次，固定30 min(4%甲醇),染色10 min后清洗3次，在显微镜下进行观察并拍照，计算侵袭细胞数(小室下表面紫色细胞数量),用Image-J图像分析软件处理。

1.3.6 J82细胞迁移率

取24 h的细胞，调整密度(2×105个/mL),待培养的细胞密度达到90%后，进行划痕实验，置于培养箱中，37℃,5%CO2条件下培养24 h后放置显微镜下，于0 h(S0)和24 h(S24)进行拍照记录。细胞迁移率=(S0时划痕宽度或面积-S24时划痕宽度或面积)/S24时划痕宽度或面积×100%。

1.3.7蛋白免疫印迹(Wb)法检测J82细胞EMT和JNK信号通路相关蛋白表达水平

干预后提取蛋白，定量并上样，进行凝胶电泳。转膜，利用脱脂牛奶法进行膜封闭，接着加入一抗(FN、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、JNK、p-JNK及β-actin),4℃温育过夜，加入山羊抗鼠IgG的抗体稀释液，室温温育2 h,最后加入BCIP/NBT染色工作液，室温避光温育30 min或更长时间，最后在凝胶成像系统中进行图片采集。蛋白灰度用Image-J图像分析软件处理，内参为β-actin,计算目的蛋白相对表达量。

1.4统计学处理

采用SPSS20.0统计软件进行统计分析。计量资料均符合正态分布，以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett′st检验。作图软件为GraphPad Prism8.0。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1罗哌卡因干预J82细胞作用浓度的筛选

对照组和低、中、高浓度罗哌卡因组的细胞活力分别为(100.00±2.78)%、(87.01±4.04)%、(81.76±3.85)%、(65.55±4.25)%,4组比较，差异有统计学意义(F=42.840,P<0.05);高浓度罗哌卡因组细胞活力低于对照组、低浓度罗哌卡因组和中浓度罗哌卡因组，差异均有统计学意义(P<0.05),最终选择高浓度罗哌卡因组(800μmol/L)进行正式实验。

2.2罗哌卡因对J82细胞增殖率的影响

对照组、罗派卡因组、阳性药物组、抑制剂组、激活剂组的细胞增殖率分别为(36.73±0.94)%、(28.37±2.29)%、(23.68±1.07)%、(14.44±1.48)%、(35.81±0.94)%,5组比较，差异有统计学意义(F=463.081,P<0.05)。与对照组比较，罗哌卡因组和阳性药物组细胞增殖率下降(P<0.05);与罗哌卡因组比较，抑制剂组细胞增殖率下降(P<0.05),激活剂组细胞增殖率明显上升(P<0.05)。见图1。

图1EdU法检测罗哌卡因对J82细胞增殖率的影响(20×)

2.3罗哌卡因对J82细胞侵袭数的影响

对照组、罗派卡因组、阳性药物组、抑制剂组、激活剂组的细胞侵袭数分别为(138.00±6.56)、(72.67±5.51)、(55.33±3.21)、(42.00±6.24)、(107.67±5.13)个，5组比较，差异有统计学意义(F=390.984,P<0.05);与对照组比较，罗哌卡因组和阳性药物组细胞侵袭数下降(P<0.05);与罗哌卡因组比较，抑制剂组细胞侵袭数下降(P<0.05),激活剂组上升(P<0.05)。见图2。

图2Transwell小室法测定罗哌卡因对J82细胞侵袭数的影响(20×)

2.4罗哌卡因对J82细胞迁移率的影响

对照组、罗派卡因组、阳性药物组、抑制剂组、激活剂组的细胞迁移率分别为(24.78±0.68)%、(17.85±0.79)%、(14.84±0.95)%、(7.88±2.06)%、(23.21±0.62)%,5组比较，差异有统计学意义(F=327.456,P<0.05)。罗哌卡因组和阳性药物组迁移率较对照组降低(P<0.05);抑制剂组迁移率较罗哌卡因组下降(P<0.05),激活剂组迁移率较罗哌卡因组升高(P<0.05)。见图3。

图3划痕法测定罗哌卡因对J82细胞迁移率的影响(4×)

2.5罗哌卡因对J82细胞EMT相关蛋白表达水平的影响

与对照组相比，罗哌卡因组和阳性药物组E-cadherin表达水平升高(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN表达水平降低(P<0.05);与罗哌卡因组相比，抑制剂组E-cadherin表达水平升高(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN表达水平降低(P<0.05)。与罗哌卡因组相比，激活剂组E-cadherin表达水平降低(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN表达水平升高(P<0.05)。见图4、表1。

图4Wb法检测罗哌卡因对J82细胞EMT相关蛋白 表达水平的影响

表1各组J82细胞EMT相关蛋白表达水平 比较

2.6罗哌卡因对J82细胞JNK通路相关蛋白表达水平的影响

与对照组相比，罗哌卡因组和阳性药物组p-JNK表达水平降低(P<0.05);与罗哌卡因组相比，抑制剂组p-JNK表达水平明显下降(P<0.05),激活剂组p-JNK表达水平明显上升(P<0.05)。各组JNK表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见图5、表2。

图5Wb法检测罗哌卡因对J82细胞JNK通路相关蛋白 表达水平的影响

表2各组J82细胞JNK、p-JNK表达水平比较

3、讨 论

膀胱癌是泌尿系统中发病率较高的恶性肿瘤，分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌。手术是目前膀胱癌最主要的治疗方式。但肌层浸润性膀胱癌手术后易复发、转移且预后不良，因此，需要新的治疗方式和治疗药物解决这一问题[12]。罗哌卡因是一种通过抑制神经细胞钠离子通道，阻断神经兴奋与传导的长效酰胺类局部麻醉药[13]。近年来罗哌卡因被报道对多种癌症具有抗癌作用。孙全鹏等[14]研究发现，罗哌卡因可对人肝癌细胞系Hep3B迁移和侵袭起到一定抑制作用。李福祥等[15]报道罗哌卡因可抑制子宫内膜癌细胞的增殖、迁移。而罗哌卡因对膀胱癌的治疗鲜有报道。本研究发现，与对照组相比，高浓度罗哌卡因组细胞活力明显降低，提示800μmol/L罗哌卡因能降低J82细胞活力。因此，本研究选择800μmol/L罗哌卡因进行后续的实验。正式实验中，罗哌卡因组细胞增殖率、迁移率和侵袭数较对照组明显降低，提示罗哌卡因能抑制J82细胞的增殖、迁移和侵袭，有良好的医学应用前景。

EMT是肿瘤微环境调控癌细胞转移最重要的机制，上皮性标志物E-cadherin的下调和间质性标志物Vimentin的上调是EMT最主要的表现[16-17]。胡艺还等[18]研究发现，木犀草素能够对膀胱癌细胞的转移及EMT进程起抑制作用。另有曹芹等[19]报道，罗哌卡因可抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT。但是罗哌卡因对人膀胱癌J82细胞的EMT机制很少被报道。本研究发现，与对照组比较，罗哌卡因组E-cadherin表达水平升高，N-cadherin、Vimentin、FN表达水平降低，预示罗哌卡因对EMT进程起到了抑制作用。

JNK信号通路在生理环境下位于细胞质，被外界环境刺激后，进入细胞核参与细胞的增殖、分化、形态维持、细胞凋亡及转移等多种细胞生物学过程。JNK在膀胱癌中的生物学反应是很多学者研究的热点。NI等[20]报道敲除TRPM7能抑制JNK信号通路激活进而抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭。吴铁林等[21]研究发现常春藤皂苷元通过调控JNK信号通路抑制膀胱癌细胞增殖。ZHANG等[22]研究发现罗哌卡因抑制食管癌细胞的增殖、迁移是通过抑制JNK信号通路的活性发挥作用的。但关于罗哌卡因调控JNK信号通路对膀胱癌的作用机制鲜有报道。本研究发现，与对照组相比，罗哌卡因组JNK相关蛋白p-JNK表达水平明显降低，说明罗哌卡因可抑制J82细胞内JNK信号通路活性；与罗哌卡因组相比，抑制剂组在罗哌卡因的基础上加20μmol/L JNK信号通路抑制剂SP600125后，增殖率、迁移率、侵袭数，以及EMT相关蛋白、p-JNK表达水平降低，激活剂组在罗哌卡因的基础上加1μg/mL JNK信号通路激活剂茴香霉素后，明显逆转了以上指标的趋势，验证了罗哌卡因可通过阻断JNK信号通路激活抑制J82细胞的恶性行为。

综上所述，罗哌卡因可能通过抑制JNK信号通路激活阻碍人膀胱癌J82细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT进程。本研究揭示了罗哌卡因对人膀胱癌J82细胞的作用，能够为临床膀胱癌的治疗提供一定的理论基础，但膀胱癌的生物学行为是否还存在其他通路有待进一步研究。

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基金资助:河北省卫生健康委员会科研基金项目(20242031);河北省保定市科学技术研究与发展指导计划(17ZF011);

文章来源:杨欣宇,杨阳,王立娟.罗哌卡因抑制膀胱癌J82细胞增殖､迁移及侵袭的分子机制研究[J].检验医学与临床,2024,21(21):3195-3200.