全球每年新发恶性肿瘤病例高达1 930万，其中近1 000万新发病例因此死亡，可见恶性肿瘤已成为全球患者死亡的主要原因之一[1―2]。在我国，肺癌是常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率均居恶性肿瘤之首[3]。肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）两大类，其中NSCLC患者约占肺癌患者总数的85%，其5年生存率仅为15%，大多数NSCLC患者在确诊时已无法切除或发生转移[4―5]。

紫杉醇（paclitaxel,PTX）是从红豆杉科植物红豆杉的干燥根、枝叶及树皮中提取的一种二萜类生物碱，是目前最有效的抗肿瘤药物之一，可有效治疗卵巢癌、肺癌、卡波西肉瘤、宫颈癌和胰腺癌等多种恶性肿瘤[6]。1999年，PTX被美国FDA批准用于NSCLC的治疗，现已成为治疗NSCLC的一线化疗药物[7―8]。该药能促进微管蛋白聚合并阻止微管蛋白解聚，抑制微管网动力学重组，影响有丝分裂进程，使细胞阻滞于G2/M期，从而诱导肿瘤细胞凋亡[9―10]。然而，PTX存在水溶性差、生物利用率低、不良反应较明显等问题，故有必要进行剂型优化[11]。研究指出，将难溶性药物制备成纳米制剂，不仅可以解决水溶性差的问题，而且可以提高其生物利用度[12]。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（polylactic-co-glycolic acid,PLGA）具有良好的生物可降解性和组织相容性、优良的成球性能和降解速率，是美国FDA认证的安全药用辅料[13―14]。基于上述背景，本研究以PLGA为载体，制备包载PTX的纳米粒（简称“PTX-PLGA-NPs”），并考察其理化性质及对Lewis肺癌细胞的体外抑制作用，以期为相关制剂的研发和临床应用提供参考。

1、材料

1.1主要仪器

本研究所用主要仪器包括LC-20AT型高效液相色谱（HPLC）仪（日本Shimadzu公司）、SCIENTZ-ⅡD型超声波细胞粉碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）、ZEN-3600型激光粒度仪（英国Malvern公司）、JEM-F200型透射电子显微镜（日本JEOL公司）、756PC型紫外-可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、Countstar Rigel S2型全自动细胞荧光分析仪（上海睿钰生物科技有限公司）、FACSCantoⅡ型流式细胞仪（美国BD公司）、Spectra Max i3x型多功能酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]、TCSSP8型激光共聚焦显微镜（德国Leica公司）、BSA224S型电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]等。

1.2主要药品与试剂

PTX对照品（批号J04S11H123510，纯度≥98%）、PLGA（乳酸-羟基乙酸质量比50∶50，批号F24IS207986）均购自上海源叶生物科技有限公司；聚乙烯醇[poly(vinyl alcohol),PVA；批号C16051871]购自上海麦克林生化科技有限公司；RPMI 1640培养基、青霉素-链霉素双抗（含100 U/m L青霉素和100μg/m L链霉素）均购自美国Gibco公司；胎牛血清（FBS）购自美国Sigma公司；0.25%胰蛋白酶（含0.02%乙二胺四乙酸）购自苏州新赛美生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS）购自北京索莱宝科技有限公司；AnnexinⅤ-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒（批号556547）、PI/RNase染色缓冲液（批号550825）均购自美国BD公司；CCK-8试剂（批号20230609）、Calcein-AM/PI染色试剂盒（批号BN14041）购自北京百瑞极生物科技有限公司；甲醇为色谱纯，二甲基亚砜（DMSO）、甲醇、二氯甲烷等均为分析纯，水为纯净水。

1.3细胞

小鼠Lewis肺癌细胞LLC（编号BNCC338433）购自商城北纳创联生物科技有限公司。

2、方法与结果

2.1 PTX-PLGA-NPs的制备

本实验采用乳化溶剂挥发法制备PTX-PLGA-NPs[15]：分别称取PTX对照品2 mg、PLGA 10 mg（两者质量比1∶5），置于10 m L EP管中，滴加二氯甲烷1 g，超声2 min；待药物、PLGA溶解、混匀后，加入1%PVA溶液5m L，于冰浴中超声10 min（超声2 s、停2 s，功率200 W）使其乳化；乳化后，于40℃下以30 r/min减压旋转挥发有机溶剂，即得PTX-PLGA-NPs。

2.2 PTX-PLGA-NPs的表征

2.2.1粒径、多分散性指数及Zeta电位测定

取“2.1”项下所制PTX-PLGA-NPs 50μL，用水稀释至1 m L，采用激光粒度仪测定其粒径、多分散性指数（polydispersity index,PDI）和Zeta电位。结果（图1）显示，PTX-PLGA-NPs的平均粒径为（172.03±0.95)nm,PDI为0.098±0.012,Zeta电位为（-1.76±0.02)m V，表明所得纳米粒制剂粒径均一、分散均匀，呈负电性。

图1 PTX-PLGA-NPs的粒径和Zeta电位分布图

2.2.2微观形态学考察

取“2.1”项下所制PTX-PLGA-NPs适量，用水稀释10倍后，取混悬液1滴置于400目的碳膜铜网上，经干燥后，用2%磷钨酸钠染色，通过透射电子显微镜观察其微观形态。结果（图2）显示，PTX-PLGA-NPs呈类球形。

图2 PTX-PLGA-NPs的透射电子显微镜观察图

2.2.3包封率和载药量测定

采用HPLC法测定。精密称取PTX对照品3.20mg，置于10 m L棕色容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，得质量浓度为320μg/m L的PTX储备液。精密量取该PTX储备液适量，依次用甲醇稀释，制得质量浓度分别为160、80、40、20、10、5μg/m L的系列对照品溶液。上述溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，进样分析，记录峰面积。色谱柱为Zorbax SB-C18(250 mm×4.60 mm,5μm），流动相为甲醇-水（75∶25,V/V），流速为1 m L/min，检测波长为227 nm，柱温为30℃，进样量为10μL。以PTX峰面积（Y）对其质量浓度（X）进行线性回归，得回归方程为Y=21 071X+5 406(R2=0.999 9），结果表明，PTX在5～160μg/m L的质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系；精密度、准确度、回收率等方法学考察结果均符合2020年版《中国药典》（四部）的相关要求。

取“2.1”项下所制PTX-PLGA-NPs 1 m L，以13 000r/min离心15 min，取上清液500μL，置于5 m L容量瓶中，以甲醇定容，超声3 min后过0.22μm微孔滤膜，取滤液按上述色谱条件进样测定，记录峰面积并代入回归方程，计算得未包封PTX的量。取“2.1”项下所制PTX-PLGA-NPs 500μL置于5 m L容量瓶中，用甲醇定容，超声3 min破乳后过0.22μm微孔滤膜，取滤液按上述色谱条件进样测定，记录峰面积，代入回归方程计算得制剂中包封和未包封PTX的总量。取“2.1”项下已知质量且已干燥的PTX-PLGA-NPs，加适量甲醇溶解，超声3 min破乳后过0.22μm微孔滤膜，取滤液按上述色谱条件进样测定，记录峰面积并代入回归方程，计算得纳米粒制剂中所含PTX的量。取“2.1”项下所制PTX-PLGA-NPs适量，以13 000 r/min离心15 min，沉淀用水洗涤3次后再次离心，收集沉淀，干燥后称重，得纳米粒制剂总质量。按下式计算包封率（entrapped efficiency,EE）和载药量（drug loading,DL):EE=（微粒制剂中包封和未包封PTX的总量-液体介质中未包封PTX的量）/微粒制剂中包封和未包封PTX的总量×100%,DL=制剂中所含PTX的量/制剂总质量×100%。每样品平行测定3次。结果显示，PTX-PLGA-NPs的EE为（52.32±0.66)%,DL为（7.07±0.18）%。

2.2.4紫外-可见光吸收特征检测

取PLGA、PTX对照品和“2.1”项下所制PTX-PLGA-NPs各适量，用甲醇稀释后置于石英皿中，以甲醇作为空白对照，对其进行紫外-可见光吸收光谱（波长190～700nm）扫描。结果（图3）显示，PTX-PLGA-NPs、PTX对照品在230 nm波长处都出现了吸收峰，而PLGA在此波长下未见明显吸收峰，表明PTX经PLGA包载后，其紫外-可见光吸收特征未发生明显改变。

图3 PLGA、PTX对照品和PTX-PLGA-NPs紫外-可见光光谱图

2.2.5稳定性考察

取“2.1”项下所制PTX-PLGA-NPs适量，于4℃下避光放置7 d，并分别于放置1、2、4、7 d时测定粒径和PDI，以考察其稳定性。每样品平行测定3次。结果（表1）显示，在上述条件下，PTX-PLGA-NPs的粒径无明显变化，且平均PDI均小于0.3，表明制剂稳定性良好。

表1 PTX-PLGA-NPs稳定性考察结果

2.3 PTX-PLGA-NPs的体外抗肿瘤活性考察

2.3.1细胞存活率考察

采用CCK-8法检测。取对数生长期的LLC细胞，按每孔1×104个接种于96孔板中，于37℃、5%CO2条件（下同）下孵育过夜，待细胞贴壁后，弃去培养基，将细胞分为对照组、PTX组和PTX-PLGA-NPs组，并设置不含细胞、不含药物的空白组，每组设置5个复孔。对照组细胞加入新鲜培养基，药物组细胞分别加入含PTX对照品、PTX-PLGA-NPs(PTX质量浓度均为0.7、1.4、2.8、5.6、11.2μg/m L，参考前期预实验结果设置）的新鲜培养基。孵育24 h后，弃去培养基，每孔细胞用PBS清洗2次后，加入CCK-8试剂100μL，孵育2 h，使用酶标仪于450 nm波长处检测各孔吸光度值，并按下式计算细胞存活率：细胞存活率=（实验组吸光度值-空白组吸光度值）/（对照组吸光度值-空白组吸光度值）×100%。结果数据以x±s表示，采用SPSS 20.0软件进行统计分析（多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验），检验水准α=0.05（统计方法下同）。

结果（图4）显示，随着药物浓度的增加，PTX-PLGA-NPs和PTX对LLC细胞的毒性均随之增强；当PTX质量浓度为11.2μg/m L时，PTX-PLGA-NPs组细胞的存活率显著低于同质量浓度PTX组（P<0.05）。

2.3.2细胞存活情况检测

采用Calcein-AM/PI双染法检测。取对数生长期的LLC细胞，按每孔1×105个接种于激光共聚焦培养皿中，孵育过夜；待细胞贴壁后，弃去培养基，将细胞分为对照组、PTX组、PTX-PLGA-NPs组，每组设置3个复孔。对照组细胞加入新鲜培养基，药物组细胞分别加入含PTX对照品、PTX-PLGA-NPs(PTX质量浓度均为11.2μg/m L，参考“2.3.1”项下结果设置，下同）的新鲜培养基。孵育24 h后，弃去培养基，每皿细胞加入CalceinAM/PI染色工作液，于37℃下避光染色30 min，以PBS清洗3次后，采用激光共聚焦显微镜观察细胞的染色情况并拍照、分析。

图4 各组细胞存活率的柱形图

a：与同质量浓度PTX组比较，P<0.05。

结果（图5）显示，对照组可见明显的绿色荧光，表明细胞处于存活状态；PTX组可见部分红色荧光，表明部分细胞处于死亡状态，提示PTX对细胞具有一定的杀伤作用；PTX-PLGA-NPs组可见明显的红色荧光，且绿色荧光减弱，表明有更多的细胞处于死亡状态，提示将PTX制成纳米粒后，其细胞杀伤力明显增强。

图5 各组细胞存活情况的激光共聚焦显微图（Calcein-AM/PI双染色法）

2.3.3细胞凋亡情况检测

采用AnnexinⅤ-FITC/PI染色法检测。取对数生长期的LLC细胞，按每孔2×105个接种于12孔板中，孵育过夜；待细胞贴壁后，弃去培养基，将细胞分为对照组、PTX组、PTX-PLGA-NPs组，每组设置3个复孔。对照组细胞加入新鲜培养基，药物组细胞分别加入含PTX对照品、PTX-PLGA-NPs的新鲜培养基。孵育24 h后，弃去培养基，将细胞用PBS清洗2次，再用胰酶消化2 min；终止消化后，将细胞与PBS混合，离心后弃去上清液；将细胞用结合缓冲液100μL重悬后，依次加入AnnexinⅤ-FITC染色液、PI染色液5μL，室温避光孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

结果（图6、表2）显示，与对照组比较，PTX组、PTX-PLGA-NPs组细胞的凋亡率均显著升高，且PTX-PLGA-NPs组显著高于PTX组（P<0.05），提示PTX及其纳米制剂均可促进肺癌细胞凋亡，且PTX-PLGA-NPs的作用更强。

图6 各组细胞凋亡情况的流式细胞图（AnnexinⅤ-FITC/PI染色法）

表2 各组细胞凋亡率及G2期细胞比例的检测结果

2.3.4细胞周期分布情况检测

采用PI染色法检测。取对数生长期的LLC细胞，按每孔2×105个接种于12孔板中，孵育过夜；待细胞贴壁后，弃去培养基，将细胞分为对照组、PTX组、PTX-PLGA-NPs组，每组设置3个复孔。对照组细胞加入新鲜培养基，药物组细胞分别加入含PTX对照品、PTX-PLGA-NPs的新鲜培养基。孵育24 h后，弃去培养基，细胞用PBS清洗后，用胰酶消化3 min；终止消化后，将细胞与PBS混合，离心后弃去上清液；向细胞中加入预冷的70%乙醇1 m L，边加边涡旋，吹打混匀后于-20℃下静置过夜。次日，取上述细胞悬液，离心后弃去上清液，向细胞中加入PI染色液500μL，孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

结果（图7、表2）显示，与对照组对比，PTX组、PTX-PLGA-NPs组G2期细胞比例均显著升高，且PTX-PLGA-NPs组显著高于PTX组（P<0.05），提示PTX及其纳米制剂均可将肺癌细胞阻滞在G2期，且PTX-PLGA-NPs的作用更强。

3、讨论

本研究对所制PTX-PLGA-NPs进行了理化性质表征和体外抗肿瘤作用考察。理化性质表征结果表明，所制PTX-PLGA-NPs呈类球形，粒径均一，分散均匀，性质稳定，EE、DL分别为（52.32±0.66）%、（7.07±0.18）%，紫外-可见光吸收特性未受载体影响。

图7 各组细胞周期分布情况的流式细胞图（PI染色法）

细胞毒性实验结果显示，经PLGA包封后，PTX-PLGA-NPs对肿瘤细胞的杀伤作用明显增强，这可能是由于纳米制剂有利于提高细胞对药物的摄取和渗透，进而增强了制剂对肿瘤细胞的杀伤作用；同时，PLGA纳米粒具有良好的生物相容性和缓释性能，有利于提高PTX在肿瘤部位的富集，进而增强制剂对肿瘤细胞的杀伤作用[16]。细胞Calcein-AM/PI双染色实验结果显示，与PTX对照品相比，PTX-PLGA-NPs具有更强的体外抗肿瘤活性。相关机制研究发现，PTX可通过稳定肿瘤细胞微管蛋白并阻止其解聚，使细胞周期阻滞在G2/M期，从而促进细胞凋亡[17―18]。进一步的细胞凋亡及周期检测结果显示，经PLGA包封后，PTX-PLGA-NPs对肺癌细胞的凋亡诱导作用强于PTX对照品，同时将细胞周期阻滞于G2期的作用也强于PTX对照品，提示该纳米粒制剂能更有效地调控肿瘤细胞周期，诱导细胞凋亡。该结果可为后续相关体内研究及应用奠定基础。

总体而言，本研究所制PTX-PLGA-NPs粒径均一、分散均匀、性质稳定，其对肺癌细胞的体外杀伤作用较PTX强。

参考文献:

[3]尹周一,王梦圆,游伟程,等. 2022美国癌症统计报告解读及中美癌症流行情况对比[J/OL].肿瘤综合治疗电子杂志,2022,8(2):54-63[2024-02-22].

[13]王晓明,张智强.柚皮素-PLGA纳米粒的制备及其体内药动学研究[J].中成药,2022,44(2):356-362.

[15]岳武恒,梅瑞,蔡娟,等.胡桃醌-PLGA纳米粒制备及对A375恶黑细胞的体外抗肿瘤作用[J].中国实验方剂学杂志,2019,25(4):87-93.

[16]李宏权,宋扬,李志耀,等.丹酚酸B及其磷脂复合纳米粒抑制口腔鳞癌和白斑细胞株的作用[J].口腔颌面外科杂志,2018,28(6):314-321.文章来源:

基金资助:国家自然科学基金项目(No.82274111,No.81803738);

文章来源:王晓静,郭子硕,张海桐,等.紫杉醇PLGA纳米粒的表征及体外抗肿瘤作用研究[J].中国药房,2024,35(22):2721-2725.