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木蝴蝶素A对肝癌细胞侵袭增殖的抑制及作用机制

2024-12-12 134 上传者：管理员

摘要：目的探讨木蝴蝶素A(OA)对肝癌细胞侵袭、增殖的抑制作用及机制。方法用不同浓度(0、25、75、150μmol/L)OA对肝癌细胞系(HepG2及Huh7)处理24 h并分组，观察各组细胞形态并检测细胞活力、迁移及侵袭能力。利用活性氧荧光(DCFH-DA)探针检测不同浓度OA处理后肝癌细胞系(HepG2及Huh7)中活性氧(ROS)水平；Western印迹检测上述各组细胞中磷酸化(p)-c-Jun-N-末端激酶(JNK)、JNK、p-c-JUN、c-JUN含量。加入JNK抑制剂SP600125后观察各组细胞活力及侵袭能力。结果随着OA浓度的增加，细胞形态明显改变，细胞表面伪足明显减少；HepG2及Huh7细胞活力均显著下降(P<0.05);HepG2及Huh7细胞迁移及侵袭均显著下降(P<0.05);HepG2及Huh7细胞中ROS染色强度同步增加；HepG2及Huh7细胞中JNK通路关键蛋白p-JNK/JNK、p-c-JUN/c-JUN比值显著增加(P<0.01)。加入JNK抑制剂SP600125后HepG2及Huh7细胞(150μmol/L OA处理24 h后)活力及侵袭能力显著增加(P<0.01)。结论 OA可能通过激活肝癌细胞ROS/JNK信号通路来抑制肝癌细胞肿瘤生物学效应，从而发挥其抗肿瘤作用。

关键词：
侵袭、增殖
复发率
木蝴蝶素A
活性氧(ROS)/c-Jun-N-末端激酶(JNK)
肝癌
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肝癌是目前第五大常见癌症，在全世界癌症相关死亡原因中排名第二[1]。尽管肝癌的临床治疗如手术、化疗、放疗和靶向治疗发展迅速，但由于其复发率高和易发生转移等特征，肝癌患者预后仍不十分令人满意[2]。随着祖国医学的蓬勃发展，中药以疗效好、副作用小等特点日益引起中西方学者的关注，通过分子生物学阐明中药抑制肿瘤的相关作用机制已成为当前的研究热点[3,4]。木蝴蝶素A(OA)是从紫葳科木蝴蝶属植物木蝴蝶中提取的天然化合物，其主要化学成分为黄酮及其苷类[5],具有抗炎[6]、抗氧化[7]、抗病毒[8]和抗癌特性[9]等。OA可抑制乳腺癌细胞及非小细胞肺癌细胞的侵袭和转移[10,11]。鉴于OA的多药理功能及其在临床治疗中表现出的良好疗效。本研究拟证实OA在肝癌中的抗肿瘤功能，并初步探讨其相关机制。

1、材料与方法

1.1细胞培养

肝癌细胞系(HepG2及Huh7)购自武汉赛诺普生命科技有限公司。培养基为10%胎牛血清(FBS,Gibco)和1%青霉素/链霉素(Solarbio,北京),于37℃下含5%CO2的湿润培养箱中培养，培养基每2天更新1次。用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化细胞。取对数生长期的细胞用于下述实验。

1.2形态学观察

HepG2及Huh7细胞在6孔培养板中生长至70%～80%。然后在培养基中加入不同浓度(0、25、75、150μmol/L)的OA。24 h后利用相差显微镜(Leica,德国)记录细胞形态学变化。选择3～5个视野观察细胞形态。

1.3细胞活力测定

细胞培养于96孔板中，暴露不同浓度(0、25、75、150μmol/L)OA中24 h。利用CCK-8 (Solarbio,北京)检测细胞活力。最后利用酶标仪(Thermo,美国)上检测450 nm波长处吸光度(OD)值。检测进行3次。

1.4划痕实验

细胞培养于6孔板中。然后微量枪头在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分细胞。将损伤的单层在含不同浓度(0、25、75、150μmol/L)OA的无FBS培养基中培养24 h。在相差显微镜下观察损伤区域的闭合情况，并用NIH ImageJ图像处理程序进行定量。用DP71照相机(Olympus日本)在指定的时间间隔(0、24 h)拍摄损伤区域。

1.5侵袭实验(Transwell实验)

用8.0μm探针(BD Falcon)将2万个细胞接种到24孔细胞培养小室的上部。不做处理的细胞作为A组；B组加150μmol/L OA进行处理；C组在B组基础上加入SP600125。用涂覆的基质胶(侵袭)进行细胞侵袭能力测定。24 h后，用棉签除去小室表面的细胞。随后，在冷甲醇中固定，进行结晶紫染色后，通过洗涤去除未染色的细胞，然后在显微镜下观察和计数染色的细胞。

1.6活性氧(ROS)测定

按照制造商的说明，首先将细胞与活性氧荧光(DCFH-DA)探针(Beyotime,上海)在37℃下孵育20 min,随后将细胞核用Hoechst3342复染15 min。最后，使用荧光共聚焦显微镜(Olympus,日本)观察并采集图像。

1.7 Western印迹分析

用含有1%蛋白酶抑制剂和10%磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀(RIPA)裂解缓冲液在冰上裂解细胞30 min。在4℃下以13 500 r/min离心15 min后，收集上清液，并使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白质测定试剂盒(Beyotime,上海)进行蛋白质定量。等量蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，转膜、封闭，首先将膜与一抗在4℃下孵育过夜，然后与各自的荧光标记的二抗在室温下黑暗中孵育1 h。最后，使用Odyssey红外成像系统(LI-COR Biosciences,美国)检测目标条带。

1.8统计学方法

采用SPSS21.0软件进行t检验。

2、结果

2.1 OA以剂量依赖方式破坏肝癌细胞形态及细胞活力

随着OA浓度的增加，细胞形态明显改变，细胞表面伪足明显减少(图1);HepG2及Huh7细胞活力均显著下降，两两比较差异显著(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。见表1。

图1不同浓度OA中的细胞形态(×100)

2.2 OA以剂量依赖方式抑制肝癌细胞的迁移及侵袭能力

与0μmol/L OA组相比，随着OA浓度的增加，HepG2及Huh7细胞迁移及侵袭能力均显著下降，两两比较差异显著(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。见表1、图2。

表1不同浓度OA中细胞活力、迁移及侵袭能力比较

图2 OA以剂量依赖方式抑制肝癌细胞的迁移及侵袭(结晶紫染色)能力(×40)

2.3 OA可诱导肝癌细胞ROS生成并激活JNK信号通路

与0μmol/L OA组相比，随着OA浓度的增加，HepG2及Huh7细胞中ROS染色强度同步增加。见图3。与0μmol/L OA组相比，随着OA浓度的增加，HepG2及Huh7细胞中JNK通路关键蛋白磷酸化(p)-c-Jun-N-末端激酶(JNK)/JNK、p-c-JUN/c-JUN显著增加，两两比较差异显著(P<0.01,P<0.001,P<0.05)。见图4、表2。

图3各组细胞内ROS水平(Hoechst3342染色，×100)

图4各组细胞中p-JNK/JNK、p-c-JUN/c-JUN的表达

1～3:0、75、150μmol/L OA组

表2各组p-JNK/JNK及p-c-JUN/c-JUN水平比较

2.4 OA通过激活ROS/JNK信号通路抑制肝癌细胞肿瘤生物学活性

与B组相比，C组HepG2及Huh7细胞活力及侵袭能力显著增加(P<0.05),与A组比较，B、C组细胞活力及侵袭能力均显著降低(P<0.01,P<0.001)。见图5、表3。

图5各组细胞侵袭能力(结晶紫染色，×40)

表3各组细胞活力、比较

3、讨论

肝癌是世界上最致命的恶性肿瘤之一，晚期肝癌具有较高的转移风险，由于其对传统化疗的耐药性和药物的显著副作用[12],迫切需要新的肝癌治疗策略，天然提取物由于其良好的生物活性而被广泛用于各种抗肿瘤研究[13]。

黄酮类化合物广泛存在于植物中，含有多种物质的多酚化合物，在多种研究总均显示出良好的抗肿瘤活性。OA是一种具有强生物活性的类黄酮衍生物。在既往研究中显示出较好的抗肿瘤效果[9],可抑制乳腺癌细胞及非小细胞肺癌细胞的侵袭和转移[10,11]。但其在肝癌中的作用及相关机制尚未得到明确报道，本研究结果显示OA在体外抑制肝癌细胞增殖及侵袭，并呈现剂量相关性。

ROS是生物有氧代谢过程中产生的一类活性含氧化合物的总称，已被证明是丝裂原活化蛋白激酶家族成员的触发剂或介质，并在多种生理及病理过程中发挥重要作用，ROS的适度增加可以促进细胞增殖和分化，而过量的ROS可以通过对脂质、蛋白质和DNA造成氧化损伤来干扰细胞信号通路。丝裂原活化蛋白激酶家族的JNK对许多细胞过程是必需的，并在应激反应如炎症和凋亡中起重要作用[14,15]。既往研究显示，ROS作为第二信使可参与多种生物学效应，而ROS/JNK通路作为细胞信号转到研究中备受关注的重要通路之一，可参与包括肿瘤细胞在内的细胞增殖、分化及死亡等多种生物学过程[16,17]。在本研究中OA以浓度依赖的方式增加肝癌细胞中ROS的产生。另外既往研究表明，JNK信号通路可以转导氧化应激信号，并在各种应激刺激下诱导细胞凋亡[18],本研究同样显示，经OA处理后，JNK和p-JNK显著增强。使用JNK抑制剂SP600125后证实，JNK激活与OA抑制的肝癌细胞活力及侵袭能力有关。基于上述结果，本研究认为ROS/JNK作为重要的信号通路，参与了OA诱导的肝癌细胞肿瘤生物学活性的降低。因此OA介导的抗肿瘤作用的机制与ROS/JNK信号通路的激活显著有关。

本研究初步阐述了OA诱导肝癌细胞肿瘤生物学活性的降低的机制，证明OA可通过靶向激活ROS/JNK通路抑制肝癌细胞肿瘤生物学效应。本研究的发现可有助于更好地指导OA抗肿瘤的临床治疗并提供一定的理论依据。

基金资助:2018年河北省中医药类科研课题计划(2018325);

文章来源:王清贤,刘子琳.木蝴蝶素A对肝癌细胞侵袭增殖的抑制及作用机制[J].中国老年学杂志,2024,44(23):5776-5780.