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LINC00467调控肝细胞癌对索拉非尼耐药的作用机制

2020-07-11 353 上传者：管理员

摘要：目的探讨LINC00467调控肝细胞癌（肝癌）对索拉非尼耐药的作用机制。方法通过加权基因共表达网络分析GEO数据集GSE73571，筛选与索拉非尼耐药相关基因；并通过GO和KEGG富集分析确认与LINC00467相关的功能基因及其调控的下游基因。构建索拉非尼耐药细胞株Hep G2-R，正常Hep G2细胞设为Hep G2-。CCK-8检测索拉非尼细胞毒性和计算IC50值；荧光定量RTPCR检测LINC00467、周期蛋白依赖性激酶1(CDK1）和细胞分裂周期蛋白45(CDC45）的m RNA表达水平。两组LINC00467、CDK1、CDC45 m RNA相对表达量比较采用t检验。结果加权基因共表达网络分析筛选与索拉非尼耐药相关基因LINC00467,GO和KEGG分析确认与LINC00467相关功能及其调控下游基因CDK1和CDC45。荧光定量RT-PCR检测发现Hep G2-R细胞LINC00467 m RNA相对表达量为2.49±0.30，明显高于Hep G2-P细胞的1(t=4.91,P<0.05);si RNA干扰后LINC00467m RNA相对表达量为0.36±0.04，干扰前为1,LINC00467m RNA表达明显降低（t=-14.60,P<0.05）。转染si RNA-LINC00467可将耐药细胞对索拉非尼的IC50值从14.03μmol/L降低至7.33μmol/L。CDK1和CDC45在Hep G2-R耐药细胞中表达升高，而si RNA干扰LINC00467的表达导致CDK1和CDC45在Hep G2耐药细胞中的表达明显降低。结论基于公共数据库挖掘发现LINC00467在肝癌中高表达，LINC00467可能通过上调CDK1和CDC45参与调控细胞周期以及DNA损伤修复过程，从而促进肝癌对索拉非尼耐药。

关键词：
CDC45
CDK1
LINC00467
癌
索拉非尼
耐药
肝细胞
肿瘤用药
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索拉非尼是治疗肝细胞癌（肝癌）的一线靶向药物[1,2]。虽然临床实践已证实索拉非尼可改善肝癌患者预后，但部分患者在索拉非尼治疗初期或治疗过程中仍出现肿瘤复发转移，从而致使疗效不佳[3]。因此，探索肝癌原发或继发耐药的分子机制，对提高靶向治疗肝癌的疗效具有重要的指导意义。相关研究显示，多种长链非编码RNA(long noncoding RNA,lnc RNA）在肝癌中差异表达，并与肝癌的预后以及恶性表型密切相关[4,5]。另有研究提示，lnc RNA参与调控肝癌索拉非尼耐药，包括SNHG1、LINC-ROR、GAS5等lnc RNA[6,7,8]。然而，由于lnc RNA参与调控各种生物学行为的具体机制极为复杂，关于lnc RNA参与调控肝癌索拉非尼耐药的分子机制仍有待进一步深入探索研究。

材料与方法

一、材料

1.细胞系：

HepG2细胞购自中国科学院上海细胞库。采用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5%CO2条件的细胞培养箱中常规培养。

2.主要试剂和仪器：

进口胎牛血清、细胞培养基DMEM采购自以色列BI公司，索拉非尼药物购自美国Selleck Chemicals公司，TRIzol裂解液、逆转录试剂盒以及q PCR反应试剂盒购自日本Takara公司，CCK-8试剂采购自中国江苏碧云天公司。Lipofectamine2000试剂盒购置美国Invitrogen公司，PCR仪（Light Cycler 96）购置于瑞士Roche公司。

二、加权基因共表达网络分析

在Gene Expression Omnibus(GEO）数据库中检索“sorafenib resistance and HCC”，检索结果筛选到数据集GSE73571。下载该数据集的数据后，使用R软件中的加权基因共表达网络分析（WGCNA）分析包，构建共表达网络，根据无尺度网络的标准确定软阈值power值为12。根据确定好的power值，设定Deepsplit值为2和最小模块尺寸为30个基因，进行模块识别，并利用函数plot dendro and colors绘制树状图和颜色模块进行可视化。然后，将基因模块与分组情况进行关联分析，通过Pearson相关性分析计算基因模块的特征基因与外部各临床信息的相关系数及P值，量化基因模块与我们感兴趣性状之间的关联，从而筛选与索拉非尼耐药密切相关的基因模块[9,10]。

三、GO功能富集和KEGG通路富集分析

提取绿色基因模块中的基因信息，将其导入DAVID数据库对这部分基因进行GO功能和KEGG通路富集分析，以错误发现率值（false discovery rate,FDR)<0.05作为具有统计学差异的标准对相关功能及通路进行筛选。

四、细胞培养及耐药株构建

Hep G2细胞采用含10%胎牛血清的DMEM培养基，培养基中梯度逐渐加入1、2、4、8、16μmol/L索拉非尼刺激，每个浓度持续1周后替换下一个更高的浓度，直到加入16μmol/L索拉非尼持续培养1周，成功诱导的索拉非尼获得性耐药HepG2细胞（HepG2-R）。HepG2-R细胞后续使用含低浓度（2μmol/L）索拉非尼培养基常规培养，保持其对索拉非尼的耐药性。正常的HepG2细胞设为HepG2-P。

1.细胞转染：

通过上海吉玛公司设计并合成针对LINC00467的siRNA。HepG2-R细胞以密度2×105个/孔种植于6孔板，待细胞贴壁后，按照Invitrogen公司的Lipofectamine2000试剂盒将脂质体与siRNA混合静置，并将其转染至HepG2-R细胞中。

2.索拉非尼细胞毒性检测：

取对数生长期的Hep G2-、Hep G2-R细胞（2×104个/孔）接种于96孔板中，24 h细胞贴壁后，加入不同浓度梯度的索拉非尼，在37℃、5%CO2下培养48 h后。去掉原含有药物的培养基，每孔加入含10%CCK-8的无血清DMEM各100μl继续培养2 h。用酶标仪设定为450 nm波长测定吸光度值（A450），以对照组设定为100%存活，将数据导入Graph Pad Prism软件，采用非线性回归拟合计算细胞对索拉非尼的IC50值。

3. RNA提取及荧光定量RT-PCR检测：

使用TRIzol裂解细胞，并常规提取细胞RNA。使用PrimerScript RT Master(Takara）试剂将纯化的RNA逆转录为cDNA，参照SYBR®premix Ex Taq(TaKaRa）说明书，按10μl体系配制PCR反应液，进行PCR反应扩增，mRNA相对表达量采用公式：表达量比值=2-Ct，其中Ct=目的基因-内参基因，Ct=Ct处理组-Ct对照组。其中LINC00467上游引物：5'-G C G TA G G C C G G A C AT T T C TA-3'，下游：5'-CCTGCCATGTTGGAAACTGC-3';CDK1上游：5'-TTTCTTTCGCGCTCTAGCCA-3'，下游：5'-CAATCGGGTAGCCCGTAGAC-3';CDC45上游：5'-GGTGATCCCTGGACCAATCG-3'，下游：5'-GAGGCCACGAAGAGAAGGAC-3';GAPDH上游：5'-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3'，下游：5'-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3'。

五、统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。LINC00467、CDK1和CDC45 mRNA相对表达量等正态分布数据以±s表示，两组比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、筛选索拉非尼肝癌耐药关键基因及功能相关和下游调控基因

通过提取GEO数据库中GSE73571数据集的数据，采用R软件读取及预处理芯片数据。将表达值相似的基因进行聚类分成不同的基因模块，动态树切割可以识别模块，并用不同的颜色进行标注。随机选取3 000个基因构建基因加权网络，检验模块内基因的相关性。进一步，将基因模块与实际分组情况进行关联分析，比较索拉非尼治疗耐药组与敏感组结果，筛选绿色代表的基因模块差异最显著。通过提取绿色基因模块中的基因信息，发现其中只有1个lncRNA，即LINC00467。对绿色基因模块中的基因进行GO功能富集及KEGG通路富集分析，结果显示该模块中的基因与细胞周期、DNA损伤修复等功能密切相关。将绿色基因模块中的基因信息上传至String数据库（http://stringdb.org）构建蛋白相互作用网络，同时挑选其中的枢纽基因网络。通过对该枢纽基因网络中的基因进行系统的文献复习，发现周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependent kinase 1,CDK1）和细胞分裂周期蛋白45(cell division control protein 45,CDC45）与细胞周期、DNA损伤修复密切相关（图1)[11,12]。

图1 String数据库分析与LINC00467相关mRNA的核心网络图

二、LINC00467在肝癌中的表达及其对肝癌索拉非尼耐药的影响

Star Base V3.0(http://starbase.sysu.edu.cn/）在线分析癌症和肿瘤基因图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中LINC00467在肝癌组织中的表达情况，结果表明LINC00467基因表达的FPKM校正值在肝癌组织中为2.92±0.08，明显高于癌旁组织的1.59±0.04(t=6.33,P<0.05；图2a）。

荧光定量RT-PCR检测发现Hep G2-R细胞LINC00467 mRNA相对表达量为2.49±0.30，明显高于Hep G2-P细胞的1(t=4.91,P<0.05；图2b);si RNA干扰后LINC00467 mRNA相对表达量为0.36±0.04，干扰前为1，可将LINC00467 mRNA表达降低至约40%的水平（t=-14.60,P<0.05；图2c）。

三、肝癌索拉非尼耐药细胞及其干扰后索拉非尼细胞毒性变化

CCK-8检测索拉非尼对HepG2细胞毒性的影响，结果显示正常的HepG2-P细胞对索拉非尼的IC50为5.56μmol/L，而耐药细胞HepG2-R对索拉非尼的IC50明显升高，达14.75μmol/L。siRNA干扰LINC00467后索拉非尼的细胞毒性明显增强，细胞对索拉非尼的IC50由原来的14.03μmol/L降低至7.33μmol/L，恢复细胞敏感性（图3）。

四、LINC00467通过调控CDK1和CDC45参与肝癌索拉非尼耐药

StarBase V3.0在线工具中分析TCGA数据库中肝癌组织的CDK1和CDC45的表达，结果显示CDK1和CDC45在肝癌组织中表达水平较癌旁正常组织明显升高（图4a）。检测HepG2耐药细胞株中这两个基因的表达情况，结果显示CDK1和CDC45的表达在HepG2-R耐药细胞中表达水平明显升高（图4b）。使用siRNA干扰LINC00467的表达后，HepG2-R细胞中CDK1 mRNA表达降低至约原来水平的59.33%(t=-10.35,P<0.05；图4c），而CDC45 mRNA表达水平也降低至原来的26.67%(t=-16.92,P<0.05；图4c）。

讨论

多激酶抑制剂索拉非尼通过靶向VEGFR2、RAF、PDGFR和c-Kit等靶点，抑制肿瘤细胞的增殖和肿瘤新生血管的形成，从而发挥抑制肝癌的疗效[13]。索拉非尼作为治疗晚期肝癌的一线靶向药物，可一定程度上改善患者预后。然而，原发性和继发性耐药的问题限制了索拉非尼治疗肝癌的疗效。既往研究表明，上皮间质转化、肿瘤微环境以及相关的信号通路如PI3K/AKT、NF-κB等与索拉非尼耐药相关[14,15]。本研究通过分析GEO数据库中肝癌索拉非尼耐药相关数据集，筛选出长链非编码RNA LINC00467与肝癌索拉非尼耐药密切相关；并进一步明确了LINC00467可能通过上调CDK1和CDC45的表达促进肝癌细胞对索拉非尼耐药。

图3 CCK-8检测肝癌索拉非尼耐药细胞及其干扰后细胞毒性

图2肝癌组织LINC00467 mRNA表达

图4 LINC00467可调控肝癌细胞CDK1和CDC45 mRNA的表达

我们通过分析TCGA数据库中肝癌的数据，证实LINC00467在肝癌组织中高表达。为进一步明确LINC00467是否与肝癌索拉非尼耐药相关，通过构建HepG2索拉非尼耐药株，并通过CCK-8检测肝癌细胞对索拉非尼IC50的变化。结果显示LINC00467与肝癌耐药密切相关，且干扰LINC00467表达可明显增强肝癌对索拉非尼的敏感性。既往有研究报道LINC00467与结肠癌化疗耐药相关，而我们的研究首次证实了LINC00467参与调控肝癌对索拉非尼的耐药。

LINC00467最初被发现在神经母细胞瘤中高表达，通过抑制抑癌基因DKK1的表达从而促进细胞的存活[16]。既往研究显示，LINC00467可通过吸附miR-4779、miR-7978以及miR-20b-5p等促进肺腺癌细胞增殖、侵袭转移以及肿瘤干性等表型[17,18]。与肝癌相关的研究表明，LINC00467在肝癌中高表达，相关机制研究证实其可通过miR-9-5p参与调控肝癌细胞增殖和侵袭转移[19]。另一项研究证实，LINC00467可通过与IGF2BP3蛋白结合，从而增强TRAF5的mRNA稳定性，在转录后水平参与调控TRAF5的表达，从而促进肝癌的恶性进展[20]。关于LINC00467参与肝癌对索拉非尼耐药的具体调控机制目前仍未阐明。因此，本研究在明确LINC00467参与调控肝癌对索拉非尼耐药的基础上，进一步探索了与此相关的调控机制。通过生物信息学预测以及siRNA干扰LINC00467的表达，证实细胞周期以及DNA损伤修复相关的蛋白CDK1和CDC45与LINC00467的表达相关，且两者也在HepG2耐药细胞中表达水平升高；干扰LINC00467的表达可明显抑制CDK1和CDC45的表达。上述研究结果提示，LINC00467通过抑制CDK1和CDC45的表达，从而参与调控肝癌索拉非尼耐药。

综上所述，基于公共数据库挖掘发现LINC00467在肝癌中高表达，LINC00467可能通过上调CDK1和CDC45的表达参与调控细胞周期以及DNA损伤修复过程，从而促进肝癌对索拉非尼耐药。本研究为深入探索lncRNA参与调控肝癌索拉非尼耐药的潜在靶点和作用机制提供了新的实验依据，关于LINC00467促进肝癌靶向耐药的更具体分子机制仍有待进一步深入研究。

参考文献：

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基金:国家自然科学基金(81972263,81672419,81572398)