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AEG-1对5-氟尿嘧啶诱导的人口腔鳞状细胞癌细胞耐药性的影响

2020-07-11 270 上传者：管理员

摘要：目的:探讨星形胶质细胞升高基因-1(astrocyte elevated gene-1,AEG-1)对5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导的口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)细胞系耐药性的影响。方法:验证高(SCC15)、中(转染空质粒的对照组SCC15、CAL27)、低(CAL27)四组不同AEG-1表达量细胞模型AEG-1基因转染效果。MTT实验观察四组细胞对5-FU耐受性的变化;蛋白质印迹法和细胞划痕实验观察四组细胞在5-FU作用下caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平变化及细胞迁移能力的变化。结果:AEG-1基因在细胞中转染成功。MTT实验显示不同浓度5-FU作用四组细胞后,过表达组细胞的半数抑制浓度(IC50)为423.7μg/ml,其对照组为213.5μg/ml(P<0.05);沉默细胞组IC50值为291.6μg/ml,其对照组为463.1μg/ml(P<0.05)。Western blot显示过表达组及其对照组中5-FU的浓度分别为400μg/ml和200μg/ml时,MMP-2、MMP-9及caspase-3的表达水平开始升高(P<0.05);沉默组及其对照组中5-FU的浓度分别为240μg/ml和480μg/ml时,MMP-2、MMP-9及caspase-3的表达水平开始升高(P<0.05)。划痕实验显示加入相同浓度5-FU后过表达组细胞迁移率明显高于其对照组(P<0.05);而沉默组细胞迁移率明显低于其对照组(P <0. 05)。结论:上调/下调AEG-1表达能增加/降低OSCC细胞对5-FU的耐药性，提示OSCC细胞的耐药性可能与AEG-1表达量相关，OSCC细胞系中AEG-1的表达情况可能能间接干扰临床药物化疗的效果。

关键词：
5-氟尿嘧啶
临床药物化疗
星形细胞上调基因-1
细胞凋亡
耐药性
肿瘤用药
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口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是世界第六大常见癌症,同时也是东南亚三大常见恶性肿瘤之一,其术后易复发,死亡率高,近年来发病率有上升趋势[1,2]。目前,手术切除结合术后化学治疗和/或放射治疗是OSCC的主要治疗方案,而OSCC的5年生存率却无明显改善[3]。其中,OSCC细胞耐药导致的化疗失败是一重要原因,化疗的失败最终导致肿瘤的复发及转移。近年来,越来越多的研究表明肿瘤对化疗药物的治疗有耐受性[4]。因此探寻OSCC化疗耐药机制,寻找与OSCC预后和治疗疗效相关的标志物,有效评估治疗疗效和预测预后成为近年来OSCC研究的热点。

星形胶质细胞升高基因-1(astrocyte elevated gene-1,AEG-1)亦称为异粘蛋白(metadherin,MTDH)[5]。现已证实,AEG-1在OSCC在内的多种肿瘤组织及细胞中的表达上调,且AEG-1的表达与肿瘤的侵袭、转移和耐药等密切相关[5,6,7]。也有研究表明,AEG-1可能通过抑制细胞凋亡、诱导细胞保护性自噬、激活NF-κB信号通路、调控转录过程等诱导肿瘤细胞的耐药性[8]。因此,AEG-1极有可能成为OSCC治疗的药物靶点,为OSCC药物治疗提供新思路。本实验即旨在探讨AEG-1对5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导的OSCC细胞系耐药性的影响。

1、材料与方法

1.1材料和仪器

AEG-1高表达SCC15稳定转染细胞系、转染空载体SCC15细胞系、sh-AEG-1 CAL27细胞系、转染空载体CAL27细胞系、培养基DMEM(美国Gibco BRL公司)、MTS(美国sigma公司)、DMSO(日本aMResco公司)、5-FU(大连美伦生物科技有限公司)、兔抗人MMP-2抗体(博士德生物工程有限公司)、兔抗人MMP-9抗体(博士德生物工程有限公司)、兔抗人caspase-3(博士德生物工程有限公司)、鼠抗人N-cadherin抗体(Abcam)、鼠抗人Vimentin抗体(Abcam)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司)、细胞培养恒温箱(美国Thermo Scientific公司)、倒置显微镜(日本Nikon公司)、离心机(美国Eppendorf公司)、荧光倒置相差显微镜图像采集系统(德国Leica公司)、垂直板电泳及转膜系统(美国Bio-Rad公司)、电泳仪(美国Amersham Biosciences公司)。

1.2实验方法

1.2.1 AEG-1基因转染效果验证

取对数期生长的细胞,用PBS洗3次,用RIPA细胞裂解液裂解细胞,提取总蛋白,BCA法测总蛋白浓度,调平蛋白浓度,煮沸变性10 min。每孔上样80μg,采用SDS-PLAG凝胶电泳进行蛋白分离后,转至PVDF膜上,5%的脱脂奶粉封闭1.5 h后,TBST洗3次,一抗AEG-1(1∶800)杂交于4℃冰箱中过夜。TBST洗3次,常温下,在避光条件下杂鼠二抗(1∶10 000)。Odyssey双色红外荧光扫描成像系统扫膜,获取图像,保存图片,ImageJ software分析、定量。

1.2.2 MTT实验

取对数期生长的细胞制成细胞悬液,种于96孔板,每孔种5 000个细胞,每孔200μl细胞悬液。放入37℃、5%CO2的培养箱中至细胞贴壁,将含有不同5-FU浓度的培养基(0、50、100、200、400、800、1 600μg/ml),每个药物浓度设置6个平行孔,培养48 h后,弃去原培养基,每孔加入20μl MTS和100μl培养基。放入培养箱中4 h后,酶标仪检测490 nm波长时的吸光度值。

1.2.3 Western blot检测相关蛋白表达

在AEG-1过表达细胞系SCC15、对照空载体细胞系SCC15、AEG-1敲除细胞系CAL27、对照空载体细胞系CAL27中分别加入含不同5-FU浓度的培养基(AEG-1过表达SCC15细胞及其对照组0、50、100、200、400μg/ml;AEG-1敲减CAL27细胞及其对照组为0、60、120、240、480μg/ml),培养48 h后,提取蛋白,检测caspase-3、MMP-2、MMP-9的表达水平。

1.2.4细胞划痕实验

先用marker笔在6孔板背后画横线,每隔1 cm画一道,每孔画5道横线。每孔中6×106细胞。待细胞贴壁后,弃去原培养基,AEG-1过表达SCC15细胞及其对照组细胞加入含200μg/ml 5-FU的培养基,AEG-1敲减CAL27细胞及其对照组细胞加入240μg/ml 5-FU的培养基。等细胞铺满6孔板后,用200μl的枪头垂直于板子,在背后的横线画痕,用PBS清洗三遍,去除划下的细胞。放入37℃、5%CO2的培养箱中。0、12、24 h拍照。

1.3统计学方法

各实验重复3次,取3次结果的平均值,实验数据用平均值±标准误表示,用SPSS 22.0统计软件进行方差统计分析,组间比较采用配对t检验,以P<0.05认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1验证AEG-1基因在转染后OSCC细胞中的表达

结果显示,AEG-1基因在细胞中转染成功(图1)。

2.2转染AEG-1后OSCC细胞系对5-FU耐药性的影响

通过MTT法测AEG-1过表达SCC15细胞的半数抑制浓度(IC50)值为423.7μg/ml,其对照组为213.5μg/ml(P<0.05);AEG-1敲减CAL27细胞的IC50值为291.6μg/ml,其对照组为463.1μg/ml(P<0.05),见图2。结果表明,AEG-1可增加OSCC细胞对5-FU的耐药性。

2.3转染AEG-1后5-FU对caspase-3表达水平的影响

实验结果显示,AEG-1过表达组与其对照组中加入5-FU的浓度分别为400μg/ml和200μg/ml时,caspase-3的表达水平开始升高(P<0.05,图3)。而敲减组与其阴性对照组相比,加入5-FU的浓度为240μg/ml和480μg/ml时,caspase-3的表达水平开始升高(P<0.05,图4)。

2.4转染AEG-1后5-FU对OSCC细胞迁移的影响

划痕实验结果表明,加入相同浓度的5-FU后AEG-1过表达SCC15细胞的迁移率明显高于其对照组(P<0.05);AEG-1敲减CAL27细胞的迁移率明显低于其对照组(P<0.05,图5)。

图1转染后OSCC细胞中AEG-1的表达

图2 MTT法检测OSCC细胞系对5-FU耐药性变化

图3 5-FU作用于AEG-1 vector SCC15、Control vector SCC15细胞后caspase-3蛋白表达水平的变化

图4 5-FU作用于sh-AEG-1 CAL27、sh-control CAL27细胞后caspase-3蛋白表达水平的变化

图5细胞划痕实验结果

2.5转染AEG-1后5-FU对MMP-2、MMP-9表达水平的影响

AEG-1过表达细胞SCC15及其对照组中加入5-FU的浓度分别为400μg/ml和200μg/ml时,MMP-2、MMP-9的表达水平开始降低(P<0.05,图6)。

AEG-1敲减组细胞CAL27及其对照组中加入5-FU的浓度分别为240μg/ml和480μg/ml时,MMP-2、MMP-9的表达水平开始降低(P<0.05,图7)。

图6 5-FU作用于AEG-1 vector SCC15、Control vector SCC15细胞后MMP-2、MMP-9蛋白表达水平的变化

图7 5-FU作用于sh-AEG-1 CAL27、sh-control CAL27细胞后MMP-2、MMP-9蛋白表达水平的变化

3、讨论

首次发现AEG-1在肿瘤耐药中的作用来源于对NCI-60肿瘤细胞的药物基因组学分析,在这个研究中发现,AEG-1的表达水平与肿瘤细胞的耐药性呈正相关。随着大量的研究发现,AEG-1对化疗药物有广泛的耐药性,如5-FU、阿霉素、紫杉醇、顺铂及靶向治疗[8]。5-FU作用的底物是胸苷酸合酶,AEG-1的表达与转录因子LSF的表达呈正相关,而LSF可以诱导胸苷酸合酶的表达。因此,AEG-1可以通过增加5-FU作用的底物和5-FU分解代谢酶二氢嘧啶来诱导5-FU对肿瘤的耐药性[9]。

caspase-3在细胞凋亡中起着重要作用,是凋亡执行的重要效应分子。AEG-1介导肿瘤耐药的一个潜在机制就是通过激活促生存途径,如在无血清的培养基中,AEG-1仍能促进细胞的增殖[10]。AEG-1可通过抑制caspase-3/8的表达进而抑制细胞的凋亡,从而提高细胞的耐药性[11]。在恶性胶质瘤细胞中敲除AEG-1后,发现多烯紫杉醇诱导的细胞凋亡率升高[12]。本实验通过检测细胞的IC50值发现AEG-1的表达水平与5-FU诱导的OSCC细胞凋亡呈反比。为了进一步探讨AEG-1抑制5-FU诱导的OSCC细胞凋亡的机制,我们检测了caspase-3的表达水平,发现在AEG-1过表达SCC15细胞中当5-FU的浓度为400μg/ml时,caspase-3的表达水平升高,而其对照组细胞中5-FU的浓度为200μg/ml时caspase-3的表达水平升高;AEG-1敲减的CAL27细胞中caspase-3的表达水平开始升高时5-FU的浓度为240μg/ml,而其对照组5-FU的浓度为480μg/ml。这个结果表明,AEG-1可以抑制5-FU诱导的细胞凋亡。在乳腺癌中,有研究发现与MCF-7对照组细胞相比,MCF-7/ADM细胞中AEG-1的表达水平升高。之后敲减细胞中的AEG-1发现,MCF-7/ADM的细胞活性和IC50值明显降低,细胞凋亡率升高。此研究表明AEG-1作为一种促癌基因与肿瘤的耐药性密切相关[13]。在肝细胞癌中,AEG-1能通过增强转录因子的表达从而调节胸腺苷酸的表达水平,使肝细胞癌对5-FU产生耐药性,且细胞中的AEG-1表达水平越高,细胞对5-FU的耐药性越强,在敲除AEG-1后,细胞对5-FU的IC50值明显降低[14]。在神经母细胞瘤中敲除AEG-1后,细胞对顺铂和阿霉素的耐药性明显降低[15]。这些研究表明,AEG-1可通过抑制细胞的凋亡而提高肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。

MMPs家族蛋白不仅可以降解细胞外基质,还参与血管生成、癌症进展,尤其是促进肿瘤细胞的侵袭迁移[16]。在非甲状腺癌的研究中发现,AEG-1的表达与MMP-2、MMP-9的表达水平呈正相关[17]。在卵巢癌中发现,与对照组相比,在对顺铂耐药的卵巢癌组织中AEG-1的表达水平及淋巴结转移率升高[18]。本实验通过在AEG-1过表达/敲减OSCC细胞及其对照组细胞中加入相同浓度5-FU后,发现AEG-1过表达组其细胞迁移能力明显高于其对照组,而AEG-1敲减组其细胞迁移能力低于其对照组。为进一步探讨AEG-1与OSCC细胞迁移的关系,我们检测了MMP-2、MMP-9的表达水平,发现AEG-1的表达与MMP-2、MMP-9的表达水平呈正相关。这表明AEG-1可能通过调控MMP-2、MMP-9的表达来调节OSCC的侵袭转移,且可提高OSCC细胞对5-FU耐药性。

通过本实验我们发现AEG-1可以抑制5-FU诱导的OSCC细胞的凋亡、抵抗5-FU对细胞迁移的抑制,增加OSCC细胞对5-FU的耐药性。因此,AEG-1可以作为治疗OSCC的一个潜在治疗靶点,为改善患者的临床治疗效果提供新的思路。

刘亭亭,王婷,贾冬萍,王秀梅.AEG-1在5-氟尿嘧啶诱导的人口腔鳞状细胞癌细胞耐药中的作用[J].现代肿瘤医学,2020,28(12):1995-1999.

基金:黑龙江省自然科学基金重点项目(编号:ZD2019H002);哈尔滨市科技局科技创新人才资助项目(编号:2016RAXYJ094)