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三阴性乳腺癌对多西他赛敏感性受BECN1影响的实验研究

2020-07-11 439 上传者：管理员

摘要：目的：探讨沉默BECN1后，三阴性乳腺癌（TNBC)MDA-MB-231细胞对多西他赛敏感性变化。方法：将MDA-MB-231细胞分为干扰组、阴性对照组（NC组）和空白组，NC组与干扰组分别使用含有阴性对照慢病毒、BECN1干扰慢病毒的完全培养基培养进行转染处理，空白组不做处理。实时荧光定量PCR检测各组细胞BECN1 mRNA的表达。蛋白免疫印迹反应（Western blot, WB）检测各组细胞BECN1蛋白的表达。CCK-8法检测多西他赛处理各组细胞后的半抑制浓度（IC50）。流式细胞术检测多西他赛干预48 h后各组细胞的凋亡率。结果：荧光显微镜下可观察干扰组、NC组干扰慢病毒感染效率均达95%以上。实时荧光定量PCR结果显示，与空白组及NC组比较，干扰组BECN1 mRNA的表达显著降低（P<0.05）。WB实验结果显示，与空白组及NC组比较，干扰组BECN1蛋白的表达显著降低（P<0.05）。CCK-8结果显示，多西他赛干预48 h后，与空白组及NC组比较，干扰组IC50显著减小（P<0.05），多西他赛呈浓度依赖性抑制MDA-MB-231细胞的增殖，在同一浓度下，干扰组细胞增殖抑制率高于空白组及NC组（P<0.05）。流式细胞术结果显示，0.1μg/mL多西他赛干预48 h后，与空白组及NC组比较，干扰组细胞凋亡率明显减小（P<0.05）。结论：通过RNA干扰沉默BECN1基因能提高多西他赛对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用，但减弱了多西他赛诱导三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡效果，提示BECN1有可能成为治疗三阴性乳腺癌细胞化疗耐药的一个重要靶点。

关键词：
三阴性乳腺癌
多西他赛
耐药
肿瘤用药
自噬
自噬相关基因
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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，是癌症相关性死亡的主要原因。三阴性乳腺癌（Three-negative breast cancer,TNBC）即雌激素受体（Estrogen receptor,ER）和孕激素受体（Progesterone receptor,PR），人表皮生长因子受体-2(Human epidermal factor 2,HER-2）均阴性表达的乳腺癌[1]。TNBC占女性乳腺癌的15%～20%，此类乳腺癌具有较高的侵袭性，预后极差[2]。因TNBC缺乏相关受体，无法针对性使用内分泌药物及分子靶向药物等，药物治疗仍停留在细胞毒性药物的使用，治疗效果不理想[3]。为此，为TNBC寻找有效的新的治疗方法显得极为迫切[4]。BECN1是哺乳动物的特异性自噬基因，其与酵母自噬相关基因6(Autophagy associated gene,ATG6）同源，与吞噬泡的形成相关，位于人类染色体17q21[5]。BECN1通过促进吞噬泡的形成和成熟，促进自噬水平[6]。本课题组的前期研究发现，隐丹参酮作用于MDA-MB-231细胞后，可促进BECN1的表达和LC3B蛋白的转化，促进细胞自噬[7]，该结果可能导致MDA-MB-231细胞对隐丹参酮产生耐药。有研究表明[8,9]，在乳腺癌中，自噬的上调可允许肿瘤细胞在治疗引起的应激中存活，从而促进耐药的发生。肿瘤细胞在放化疗后，其内部会产生大量破损的细胞器、蛋白等对细胞不利的成分，而BECN1等调控的自噬可以保护肿瘤细胞免受抗肿瘤治疗的影响，并提供应急的底物及能量，为肿瘤细胞的修复赢得时间和条件[10]。Tai等[11]早期研究也发现自噬可以促进肺腺癌细胞对多西他赛的抵抗性，降低其敏感性。相反，通过氯喹抑制细胞自噬可增强皮肤鳞状细胞癌对多西他赛的敏感性[12]。因此，BECN1与肿瘤化疗耐药关系密切。但对于TNBC，此方面的报道极少，BECN1与肿瘤细胞的化疗抵抗关系仍未明了。针对三阴性乳腺癌的难治性，BECN1能否作为TNBC治疗中抵抗化疗耐药的新靶点，具有较高的研究价值。本实验中，笔者通过RNA干扰沉默BECN1基因，多西他赛处理转染前后各组细胞，初步探讨沉默BECN1后，三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞对多西他赛敏感性变化，为BECN1靶点应用于TNBC防治提供理论依据。

1、材料与方法

1.1试剂

多西他赛（生产批号：D1930061，美国阿拉丁公司）；DMEM高糖培养基、胰酶、青—链霉素双抗（美国GIBCO公司）；胎牛血清（以色列Biological Industries公司）、总RNA提取试剂盒、反转录第一链cDNA合成试剂盒、FastStart Universal SYBR Green Master、PCR引物（日本TAKARA公司）、兔抗人BECN-1单克隆抗体、兔抗人LC3B单克隆抗体、兔抗人GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）、Annexin v/7-aad细胞凋亡检测试剂盒（美国Thermo Scientific）、CCK-8(日本同仁)。

1.2细胞系

人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞购自procell公司（含STR鉴定证书）；BECN1干扰慢病毒由上海吉玛生物公司代为构建、包装。

1.3方法

1.3.1细胞培养

人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞使用含有10%FBS、100 U/L青霉素及100μg/L链霉素的高糖DMEM培养基于37℃含5%CO2胞培养箱中培养。

1.3.2细胞分组与转染

MDA-MB-231细胞分为空白组、NC组及干扰组培养细胞使其融合度达50%至70%时，按照感染复数（MOI)=10,NC组与干扰组分别使用含有阴性对照慢病毒、BECN1干扰慢病毒的完全培养基培养进行转染处理，72 h后于荧光显微镜下观察细胞发光情况，之后予以嘌呤霉素持续筛选一周，以获得稳定转染的细胞株。

1.3.3实时荧光定量PCR检测各组细胞BECN1mRNA的表达

取培养至融合度80%～90%处于对数期的各组细胞，提取其总RNA，检测纯度及浓度，逆转录合成c DNA，在steponeplus荧光定量PCR仪上进行PCR反应，反应条件：预变性，95℃，30 s(1个循环）；变性，95℃，5 s；退火及延伸，60℃，30 s（共40个循环）。根据反应CT值，采用2-△△CT法计算各组细胞BECN1 mRNA的相对表达量。

1.3.4蛋白免疫印迹反应（Western blot,WB）

检测各组细胞BECN1蛋白的表达PBS清洗各组细胞后，各组细胞分别加入300至500μL含PMSF的高效裂解液于冰上裂解30 min，收集裂解液至1.5 m L EP管中，4℃，12 000～14 000 r/min离心5 min，取上清液即为所提取的细胞总蛋白。BCA法测各组总蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳（80 V/120 V），将蛋白条带湿转法转至PVDF膜（110 mA,120 min）,封闭液封闭5 min,TBST洗膜3次（5 min/次），一抗4℃孵育8 h或过夜，TBST洗膜3次（5 min/次），二抗室温孵育2 h,TBST洗膜3次（5 min/次），ECL发光，用FCQ凝胶图像分析系统扫膜及分析条带灰度值，以BECN1蛋白条带灰度值与GAPDH蛋白条带灰度值的比值表示BECN1的相对表达量。

1.3.5 CCK-8法检测多西他赛对各组细胞处理后的半抑制浓度（IC50）

取生长状态良好、无污染的处于对数期的各组细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，用完全培养基将细胞密度调为5×105个/mL。分别将上述各组细胞接种于96孔板，每孔接种100μL，即每孔接种50 000个细胞。细胞贴壁后，吸弃旧培养基，并分别加入含不同浓度多西他赛（0.000 8μg/mL、0.004μg/mL、0.02μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL）的完全培养基，每个浓度设置6个复孔，并设置空白孔和对照孔，将各组细胞置于37℃，5%CO2培养箱继续培养48 h。分别将各组细胞置于酶标仪上，在450 nm波长处测量各孔的吸光度值（OD值），计算不同浓度多西他赛作用下，各组细胞的增殖抑制率。计算公式：细胞增殖抑制率=[（Ac-As)/（AcAb）]×100%。其中，As:实验孔吸光度（含细胞、培养基、CCK-8和多西他赛）；Ac：对照孔吸光度（含细胞、培养基、CCK-8溶液、不含多西他赛）；Ab：空白孔吸光度（含培养基、CCK-8溶液，不含细胞、多西他赛）。

1.3.6流式细胞术检测各组细胞凋亡率

将生长状态良好、处对数期无污染的各组细胞分别接种于6孔板，并设置另外个孔常规培养正常的MDA-MB-231细胞，用于调机。除了调机孔，其余细胞均使用含多西他赛0.1μg/mL的完全培养基培养。培养48h后使用不含EDTA的胰酶消化细胞，用预冷的PBS清洗2次，再用1 mL 1×的Binding Buffer悬浮细胞，300 g离心10 min，弃上清。用1 mL 1×的Binding Buffer重悬细胞，使细胞密度达到1×106个/mL。分别在EP管中加入100μL各组细胞悬液，再向管中加入5 u L Annexin V-FITC，室温避光下轻轻混匀10min。加入5 uL 7-AAD，室温，避光，孵育5 min。加入PBS至总体积为500μL，轻轻混匀。在1 h内用流式细胞仪检测，取流式散点图的右上、右下象限作为总细胞凋亡率。

1.4统计学方法

采用SPSS26.0统计软件分析数据，符合正态分布计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1慢病毒感染MDA-MB-231细胞的效率

以BECN1干扰慢病毒和空载慢病毒分别感染MDA-MB-231细胞72 h后，置于倒置荧光显微镜下观察，明、暗视野对比，干扰组和NC组慢病毒感染效率均达95%以上，见图1。

图1慢病毒感染效率评价（×100)

图1慢病毒感染效率评价（×100) 下载原图

2.2 3组细胞BECN1 mRNA的相对表达量比较

荧光定量PCR实验结果显示，空白组、NC组及干扰组BECN1 mRNA的相对表达量分别为（1.00±0.06）、（0.98±0.03）和（0.11±0.01），干扰组BECN1mRNA的相对表达量低于空白组和NC组，差异有统计学意义（P<0.05）；空白组和NC组BECN1 m RNA相对表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图2、图3。

图2 PCR扩增曲线

图3各组细胞BECN1 mRNA表达水平柱状图

2.3三组细胞BECN1蛋白的相对表达量比较

干扰组BECN1蛋白的相对表达量低于空白组和NC组，差异有统计学意义（P<0.05）；空白组和NC组BECN1蛋白的相对表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图4，图5。

2.4 3组细胞多西他赛IC50比较

空白组、NC组和干扰组IC50分别为（0.09±0.00）μg/mL、（0.09±0.01）μg/mL、（0.05±0.01）μg/mL，干扰组细胞多西他赛IC50低于空白组及NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。多西他赛呈浓度依赖性抑制MDA-MB-231细胞的增殖，在同一浓度下，干扰组细胞增殖抑制率高于空白组及NC组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.5 3组细胞凋亡率比较

多西他赛处理48 h后，干扰组细胞凋亡率低于空白组和NC组，，差异有统计学意义（P<0.05）；空白组和NC组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图6，图7。

图4各组细胞BECN1蛋白的表达

图5各组细胞BECN1蛋白表达柱状图

表1多西他赛对各组细胞的生长抑制率

与空白组及阴性对照组比较，*P<0.05。

图6多西他赛对各组细胞凋亡率的影响

图7各组细胞凋亡柱状图

3、讨论

TNBC恶性程度高，早期易转移，目前TNBC在药物治疗方面，主要以紫杉类、蒽环类及铂类药物的系统性化疗为主[3,13]。微管是真核细胞的组成成分之一，在肿瘤细胞中，微管和微管蛋白二聚体之间存在着动态平衡。多西他赛可打破微管和微管蛋白二聚体间的这种动态平衡状态，其主要机制是诱导并促进微管蛋白聚合的发生，导致肿瘤细胞在进行有丝分裂时无法形成纺锤体和纺锤丝，使肿瘤细胞的分裂、增殖受到抑制[14]，蒽环类药物则抑制肿瘤细胞DNA复制及RNA合成，阻止肿瘤细胞分裂和增殖。受细胞BECN1调控的自噬等多种耐药机制的影响，TNBC患者对该系统性化疗的敏感性大为降低。BECN1与多种肿瘤的发生、发展及预后密切相关[15,16]，在肿瘤化疗治疗的过程中，一方面BECN1可通过促进过度自噬诱导肿瘤细胞凋亡，该过程被称作细胞Ⅱ型程序性死亡，另一方面BECN1又能够促使肿瘤细胞产生保护性自噬，增强肿瘤细胞的耐药性[17],这种对立的作用使得肿瘤的化疗变的错综复杂。本课题组前期研究也发现，当隐丹参酮作用于MDA-MB-231细胞后，可促进BECN1的表达和LC3B蛋白的转化，促进细胞自噬[7]。据此，本实验通过RNA干扰沉默BECN1基因，多西他赛处理转染前后各组细胞，初步探讨沉默BECN1后，三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞对多西他赛敏感性变化。

本研究结果显示，细胞感染慢病毒后，其生长迅速，72 h后于倒置荧光显微镜下可见细胞荧光发光率达95%以上，转染后细胞BECN1 mRNA和BECN1蛋白的表达均显著降低，BECN1沉默效率达89.9%，提示转染成功。CCK-8实验结果发现，多西他赛呈浓度依赖性抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖，且通过RNA干扰沉默BECN1基因后，该增殖抑制作用被显著提高，显示出该三阴性乳腺癌细胞对多西他赛的敏感性增强。但流式细胞术实验结果则显示，当沉默BECN1基因后，多西他赛致MDA-MB-231细胞凋亡的效果会被减弱。整个实验表明了BECN1基因沉默后三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞对多西他赛敏感性的双重变化。在此前有研究表明，在缺氧状态下，TNBC干细胞能通过自噬途径产生耐药，而使用一些自噬相关的分子或化学抑制剂能逆转其耐药[18]。但也有研究发现，当抗凋亡蛋白BCL-2通过直接结合在BECN1/Atg6的BH3结构域抑制自噬后，会抑制肿瘤细胞的自噬性死亡，导致肿瘤细胞对化疗药物的耐药[19]，可通过上调BECN1蛋白的表达来诱导肿瘤细胞发生自噬性死亡。Ouyang等[20]发现，将小分子化合物LYN-1604作用于三阴性乳腺癌细胞后，能活化自噬关键激酶ULK1，进而诱发自噬性的细胞凋亡。这些研究结果表明了BECN1与自噬在肿瘤细胞化疗耐药中的双重作用，BECN1在乳腺癌化疗耐药方面，存在着正反两方面的观点。在本研究中，沉默BECN1后，多西他赛对MDA-MB-231的增殖抑制作用增强，我们认为可能与细胞的保护性自噬减弱存在一定关系，在多西他赛治疗应激下自噬向肿瘤细胞提供营养和能量有所减少；而多西他赛致MDA-MB-231细胞凋亡的效果减弱，其机制可能与自噬诱导的细胞Ⅱ型程序性死亡减少有关。但其中相关分子机制及调控通路等，有待我们更深入的研究与探讨。

综上，BECN1与乳腺癌存在着双重关系，已成为潜在的抗癌药物和靶向性的目标，如何利用其对肿瘤“助生”与“促死”的两面性，有待更深入地研究。BECN1作为三阴性乳腺癌新的治疗焦点，有极大的前景。我们相信随着更多的基因组学等技术的发展与应用及各种有效乳腺癌治疗药物的顺利开发，我们将进一步实现乳腺癌精准治疗和改善乳腺癌患者的生存预后。

参考文献：

[7]全军利,贺文兴,吴斯敏,等.隐丹参酮对乳腺癌MD A-MB-231细胞自噬和侵袭迁移的影响[J].广西医科大学学报,2015,33(1):23-26.

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[17]樊晓东,甄林林,刘敏敏,等.YM155诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231自噬并促进其凋亡[J].南京医科大学学报,2015,35(12):1697-1702.

樊海波,全军利,王桂芬,张浩然,钟俊,刘志明.BECN1影响三阴性乳腺癌对多西他赛敏感性的实验研究[J].广西医科大学学报,2020,37(06):1053-1058.

基金:2015年广西自然科学基金资助项目(No.2015GXNSFAA139225)