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miR-204-5p在结直肠癌细胞对奥沙利铂化疗耐药性中作用机制

2024-12-13 58 上传者：管理员

摘要：目的探讨miR-204-5p在结直肠癌奥沙利铂(L-OHP)化疗耐药性中的作用及潜在分子机制。方法比较L-OHP耐药及非耐药结直肠癌组织及细胞中miR-204-5p的表达水平；检测过表达miR-204-5p后结直肠癌细胞系的细胞活力、增殖及凋亡水平；TargetScan信息学分析miR-204-5p的作用靶点并利用双荧光素酶报告实验进行验证；检测过表达miR-204-5p及酪氨酸蛋白激酶受体B6抗体(EPHB6)后结直肠癌细胞系的增殖及凋亡水平。结果 miR-204-5p在L-OHP耐药癌组织及细胞中的表达显著降低(P<0.05);过表达miR-204-5p后结直肠癌细胞系细胞活力及增殖能力显著降低、细胞凋亡显著增加(P<0.05);TargetScan信息学分析显示，EPHB6可能为miR-204-5p的作用靶点；过表达miR-204-5p及EPHB6后结直肠癌细胞系细胞增殖能力显著增加，凋亡水平显著降低(P<0.01,P<0.001)。结论 miR-204-5p可通过靶向EPHB6降低结直肠癌细胞对L-OHP的耐药性。

关键词：
miR-204-5p
手术
结直肠癌
耐药
酪氨酸蛋白激酶受体B6抗体(EPHB)6
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结直肠癌是目前全球第3大恶性肿瘤[1]。尽管对于未转移患者而言，手术仍是该疾病的主要治疗手段，但约一半患者可出现肿瘤转移和复发，因此，化疗是结直肠癌治疗中的重要方法[2]。奥沙利铂(L-OHP)可以通过与DNA结合共价抑制DNA复制和转录，导致细胞凋亡[3]。然而肿瘤细胞的耐药性是目前化疗主要的阻碍之一[4]。因此，寻求L-OHP耐药相关信号通路关键分子的识别，对结直肠癌的有效治疗至关重要。

微小RNA(miRNAs)是一组非编码RNA,可在肿瘤的多个方面发挥重要作用，其中包括肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移及耐药的发生等[5,6]。在结直肠癌中，许多miRNAs呈现出异常表达模式，有些已经被证明是通过靶向肿瘤相关的基因进而发挥作用[7,8]。其中miR-204-5p是结肠直肠中下调最显著的miRNAs之一[9],miR-204-5p在结直肠癌中下调与患者预后不良密切相关[10]。本研究利用结直肠癌样本和细胞系研究miR-204-5p在结直肠癌L-OHP化疗耐药性中的作用及其潜在的分子机制。

1、资料与方法

1.1组织样本

收集2020年2月至2021年7月衡水市人民医院10例L-OHP耐药及10例非L-OHP耐药结直肠癌患者癌组织。患者均知悉研究内容并签署知情同意书。本研究中的所有材料和方法已获得医院伦理委员会批准。

1.2细胞培养

结肠直肠癌细胞HCT116及SW480购自中国科学院细胞库(上海)。L-OHP耐药结肠直肠癌细胞HCT116/L-OHP和SW480/L-OHP是通过在常规细胞培养条件下将亲代细胞逐渐暴露于浓度增加的L-OHP,以选择抗性细胞而建立的。所有细胞都用10%胎牛血清(FBS,Gibco)和1%青霉素/链霉素(Solarbio,北京),于37℃下含5%CO2的湿润培养箱中培养。

1.3 RNA提取和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)

按照制造商的方案，使用Trizol试剂(Sigma,美国)从组织样本和细胞中提取总RNA。通过使用TaqmanMicroRNA逆转录工具包(应用生物系统),将5μg总RNA逆转转录成cDNA。用茎环RT引物进行逆转录，用生物RadCFX96real-进行定量qRT-PCR。GAPDH为内部对照。

1.4细胞转染

miR-204-5p模拟物(miR-204-5p mimic)及其阴性对照(miR-NC)、pcDNA-酪氨酸蛋白激酶受体B6抗体(EPHB6)及其阴性对照分别购自Gene Pharma(中国上海)。实验分为miR-NC组、miR-204-5p mimic组、pcDNA-NC组、pcDNA-EPHB6组miR-NC+pcDNA-NC组、miR-204-5p mimic+pcDNA-NC组、miR-204-5p mimic+pcDNA-EPHB6组。按照制造商(Invitrogen,美国)的说明，使用Lipofectamine®2000进行质粒和pc-DNA转染。利用转染技术对HCT116/L-OHP和SW480/L-OHP细胞系中miR-204-5p进行过表达，并对HCT116/L-OHP和SW480/L-OHP细胞中miR-204-5p与EPHB6表达水平进行调控。

1.5荧光原位杂交

取组织切片，65℃恒温箱烤片过夜，二甲苯脱蜡2次后复水，再于胃蛋白酶溶液中消化15 min,并用核酸杂交漂洗液(2×SSC)中漂洗2次后梯度乙醇脱水后，自然干燥。取出切片至梯度酒精脱水、45℃预热5 min后与探针于42℃环境中过夜杂交，取玻片甲酰胺洗涤，自然干燥后加Hoechst复染，静置25 min后置于荧光显微镜下观察并采集图像。

1.6细胞活力测定

细胞培养于96孔板中，暴露于L-OHP(浓度为4μmol/L)48 h。利用CCK-8 (Solarbio,北京)检测不同时间(0、1、2、3、4 d)细胞活力。在酶标仪(Thermo,美国)上检测450 nm波长处吸光度(OD)值。检测至少进行3次。

1.7 EDU法检测细胞的增殖能力

将各组细胞接种在24孔板中(密度为1×105个/孔)培养24 h(37℃),随后向每孔中添加10μmol/L EDU(Thermo,美国),24 h后将细胞在40 g/L多聚甲醛中固定15 min,同时用0.5% Triton X-100促渗20 min。使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液对细胞核进行染色。最后通过荧光显微镜观察荧光阳性细胞，采集图像并进行数据分析。

1.8流式细胞法检测细胞的凋亡水平

细胞暴露于L-OHP(浓度为4μmol/L)48 h,胰蛋白酶消化，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，1 000 r/min,离心5 min,去上清液，PBS冲洗两次，用膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(AnnexinⅤ/FITC)凋亡检测试剂盒进行染色，每个样本中加入500μl 1×缓冲液，吹打成单细胞悬液，后加入AnnexinⅤ和碘化丙啶(PI)各5μl, 37℃避光染色20 min后，用FACSAriaTM流式细胞检测染色细胞，WinMDI2.9软件进行分析。

1.9双荧光素酶报告基因检测

处于对数生长期的细胞接种于96孔板中，通过脂质体转染试剂盒，将Renilla荧光素酶报道基因和miR-204-5p mimic片段进行共转染。继续培养48 h后，最后对荧光素酶活性进行分析。

1.10免疫组织化学染色

对L-OHP耐药及非L-OHP耐药结直肠癌组织进行切片，切片于室温下与10%牛血清白蛋白(BSA,含0.3% Triton X-100)孵育1 h。加入一抗EPHB6(赛默飞，美国，1∶1 000)4℃下孵育过夜，PBS洗涤后，加入二抗，随后室温下避光孵育2 h。再次PBS洗涤，加入DAPI染色液，最后在光学显微镜下观察并采集图像。

1.11 Hoechst染色

对数生长期的细胞接种于48孔板，CO2培养箱培养中过夜(温度为37℃)。弃去培养基，PBS洗涤，每孔加入200μl的4%多聚甲醛固定液，室温固定30 min。每孔加入200μl的0.1% Triton X-100,室温静置15 min。洗涤3次后进行封闭，37℃孵育2 h,弃去液体。加入一抗EPHB6(赛默飞，美国，1∶500)过夜(温度为4℃)。洗涤3次后再次封闭后加入二抗，37℃避光孵育1 h。洗涤3次后进行染核，每孔加入200μl Hoechst(浓度2μg/ml),室温避光染色15 min。最后置于荧光显微镜下观察并采集图像。

1.12 Western印迹

对样本中蛋白质浓度进行测定，随后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),转膜、封闭。加入EPHB6抗体及GAPDH抗体(碧云天，上海，1∶1 000),室温下孵育2 h。加入二抗(1∶1 000)再次孵育1 h,最后利用电化学发光(ECL)系统(Biorad,美国)检测蛋白质条带。

1.13统计学方法

采用SPSS24.0软件进行t检验、单因素方差分析、Tukey法。

2、结果

2.1 L-OHP耐药的结直肠癌细胞中miR-204-5p表达

在结直肠癌细胞HCT116及SW480中加入梯度浓度L-OHP,结果显示随着L-OHP浓度升高，细胞中miR-204-5p表达水平显著降低(P<0.05)。见表1。与L-OHP非耐药组织[(100.01±10.36)%]相比，miR-204-5p在L-OHP耐药组织中表达[(25.06±8.74)%]明显降低(P<0.05)。见图1。另外与结直肠癌细胞HCT116及SW480[(100.06±3.54)%、(101.03±2.95)%]相比，其耐药细胞系HCT116/L-OHP和SW480/L-OHP中miR-204-5p表达水平[(25.28±4.32)%、(20.12±3.45)%]显著降低(P<0.05)。

表1不同浓度L-OHP对结直肠癌细胞中miR-204-5p表达

2.2过表达miR-204-5p可逆转结直肠癌细胞L-OHP耐药性

与miR-NC组相比，miR-204-5p-mimic组细胞活力(1、2、3、4 d)及增殖能力显著降低，细胞凋亡能力显著增加(P<0.05)。见表2、图2、表3、图3。

图1耐药与非耐药结直肠癌组织(免疫荧光，×400)

2.3 EPHB6为miR-204-5p的直接作用靶点

TargetScan信息学分析显示，EPHB6可能为miR-204-5p的作用靶点。见图4。在HCT116/L-OHP和SW480/L-OHP细胞中，将EPHB6和miR-204-5p的野生型(WT)或突变体(MUT)3′-UTR共转染，并进行荧光素酶报告实验。共转染实验显示，过表达miR-204-5p显著降低了HCT116/L-OHP和SW480/L-OHP细胞EPHB6-WT的荧光素酶活性，而使用突变体则无明显改变(P>0.05)。见表4。与L-OHP非耐药组织相比，L-OHP耐药癌组织中表达显著增加(P<0.05)。见图5。另外人结直肠癌组织中miR-204-5p和EPHB6蛋白表达水平呈明显负相关(r=-0.756 7,P=0.028 8)。见图6。与HCT116及SW480细胞相比，HCT116/L-OHP和SW480/L-OHP细胞中EPHB6表达明显增加(P<0.05)。见图7。

表2过表达miR-204-5p后不同时间点HCT116/L-OHP和SW480/L-OHP细胞活力

图2流式细胞术评估过表达miR-204-5p后HCT116/L-OHP和SW480/L-OHP细胞凋亡水平

表3过表达miR-204-5p后HCT116/L-OHP、SW480/L-OHP细胞中miR-204-5p表达、细胞增殖及凋亡能力比较

图3过表达miR-204-5p后HCT116/L-OHP和SW480/L-OHP细胞增殖能力(EDU染色，×400)

2.4 miR-204-5p通过靶向EPHB6降低结直肠癌细胞对L-OHP的耐药性

转染miR-204-5p mimic明显抑制EPHB6 mRNA和蛋白表达，而转染pcDNA EPHB6显著上调细胞中EPHB6 mRNA和蛋白表达(P<0.05)。与空白转染组相比，miR-204-5p-mimic组细胞增殖能力显著降低，凋亡水平显著升高(P<0.05);与miR-204-5p-mimic组细胞相比，miR-204-5p-mimic+pcDNA-EPHB6组细胞增殖能力显著增加，凋亡水平显著降低(P<0.05)。见表5、表6、图8。

图4 TargetScan预测miR-204-5p的潜在靶标

表4荧光素酶报告实验验证miR-204-5p与EPHB6的靶向关系

图5 L-OHP非耐药组织与耐药癌组织EPHB6表达(En Vision染色，×400)

图6 miR-204-5p与EPHB6的关系

图7 L-OHP敏感细胞与耐药癌细胞中EPHB6表达(×600)

表5 HCT1116/L-OHP和SW480/L-OHP中EPHB6 mRNA及蛋白表达比较

表6 HCT116/L-OHP和SW480/L-OHP细胞增殖能力及凋亡能力比较

图8 Western印迹检测共转染miR-204-5p mimic和pcDNA-EPHB6后细胞中EPHB6蛋白表达

3、讨论

流行病学数据显示，结直肠癌新病例数占世界新发恶性肿瘤病例的9.4%[11]。随着环境的破坏及生活方式的改变，结直肠癌的发病率预计将继续上升。传统的结直肠癌治疗以手术为基础，并辅以放疗和化疗，结直肠癌的药物治疗包括化疗和靶向药物治疗[2]。然而无论是细胞毒性药物还是靶向药物，都不能避免耐药性的问题，因此，耐药性是影响肿瘤疗效及预后的主要原因。L-OHP是一种用于治疗结直肠癌的化疗药物，可以单独使用或与其他药物联合使用[12]。然而，使用L-OHP治疗后经常发生耐药性，导致化疗疗效降低，甚至失败[13,14]。因此，提高L-OHP对结直肠癌的治疗效果，克服临床治疗中肿瘤细胞的耐药性至关重要。

大量研究显示，miR-204-5p与结直肠癌疾病的发展及预后不良密切相关[9,10],此外，miR-204-5p可通过靶向相关癌基因影响肝癌和神经母细胞瘤的化疗耐药性[15,16],但miR-204-5p是否参与结直肠癌L-OHP耐药尚未可知。肿瘤细胞耐药机制有多种，包括细胞活力、增殖能力增加及凋亡减少等[17]。本研究说明，过表达miR-204-5p可逆转结直肠癌细胞L-OHP耐药性。

本研究证实，miR-204-5p可直接靶向EPHB6,抑制结直肠癌的细胞活力，增强细胞凋亡。在miR-204-5p过表达的细胞中，增加EPHB6表达可以逆转miR-204-5p过表达引起的细胞的增殖能力降低、凋亡增加。EPHB6属于跨膜蛋白家族的成员，是肾上腺素β家族蛋白受体，EPHB6活性可以影响细胞的黏附和迁移[18]。本研究结果显示，EPHB6在结直肠癌中表达增加预示着肿瘤细胞耐药，过表达EPHB6可以显著增加L-OHP耐药细胞的增殖能力；表明EPHB6是结直肠癌潜在的新致癌基因和预后因子。miR-204-5p通过靶向EPHB6调控结直肠癌细胞对L-OHP的耐药性，提示miR-204-5p/EPHB6信号通路可能成为结肠直肠癌预防和治疗策略的新靶点。

综上，miR-204-5p可通过靶向EPHB6降低结直肠癌细胞对L-OHP的耐药性，但其中具体作用机制有待进一步研究。

基金资助:2019年衡水市科技计划(2019014032Z);

文章来源:杨芳,侯倩倩,李娜,等.miR-204-5p在结直肠癌细胞对奥沙利铂化疗耐药性中的作用及机制[J].中国老年学杂志,2024,44(23):5811-5817.