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脑胶质瘤细胞中泛素结合酶10的表达及临床意义

2021-03-22 1226 上传者：管理员

摘要：目的：探讨泛素结合酶10(Ubch10)在脑胶质瘤细胞中的表达及临床意义。方法：选取2017年7月至2019年3月祁阳县人民医院收治的56例脑胶质瘤患者脑组织作为研究对象，同期选取10例正常冻存脑组织作为对照组，采用免疫组化检测脑胶质瘤细胞组织及正常组织中UbcH10含量，分析以siRNA干扰U251细胞中UbcH10表达情况，将siRNA试剂干扰后脑胶质瘤组织纳入干扰组，通过记录shRNA干扰后UbcH10表达量，分析Rb磷酸化水平与UbcH10的关系。结果：UbcH10表达量与肿瘤直径、组织学分级、浸润深度、Ki-67表达量、肿瘤转移和生存情况相关，差异均有统计学意义（P<0.05）。siRNA干扰后，干扰组UbcH10及p-Rb表达量显著低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。脑胶质瘤组织中UbcH10水平（0.91±0.09）较正常组织（0.48±0.10）升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：UbcH10在脑胶质瘤细胞中表达水平较高，并且其表达水平与调控Rb蛋白释放有关，其在脑胶质瘤的发生和发展中起到关键性作用。

关键词：
临床意义
原发性肿瘤
泛素结合酶10
脑胶质瘤细胞
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脑胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤，具有生存期短、死亡率高、侵袭性强和易复发等特点。据文献报道，世界卫生组织（WHO）根据恶性程度（Ⅰ～Ⅳ级）将其分为Ⅲ～Ⅳ级的高级别脑胶质瘤和Ⅰ～Ⅱ级的低级别脑胶质瘤，其中高级别胶质瘤占75%左右，而低级别胶质瘤也可能演变为高级别恶性胶质瘤，但由于其发生发展和演变过程极其复杂，因此，明确影响其恶性程度的关键因子对治疗该病具有重要意义[1]。泛素结合酶10(UbcH10）是一种细胞周期蛋白，参与调控细胞的有丝分裂[2]。研究表明，UbcH10可特异性降解泛素化底物，在肿瘤的发生及发展过程中具有重要作用[3]。基于此，本研究探讨脑胶质瘤细胞中Ubch10表达及其临床意义，期望为脑胶质瘤诊疗以及预后评估提供新思路。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2017年7月至2019年3月祁阳县人民医院收治的56例脑胶质瘤患者脑组织作为研究对象，选取同期10例正常冻存脑组织为对照组，所有样本均经2位以上病理学医师诊断并确诊。其中脑胶质瘤组织来源患者男26例，女30例；年龄40～70岁，平均（58.64±5.67）岁；毛细胞型星形胶质细胞瘤29例，胶质母细胞瘤14例，间变性星形胶质细胞瘤13例。

1.2试剂与方法

1.2.1试剂

鼠抗人UbcH10抗体、Rb相关抗体试剂盒、超敏链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶（SP）试剂盒、鼠抗人Ki-67抗体均购自上海煊翎生物科技有限公司。

1.2.2检测方法

(1)UbcH10蛋白表达的检测：采用免疫组化方法测定UbcH10蛋白表达，脑胶质瘤细胞组织及正常组织切成厚度为4μm的薄片，展片、烤干，脱蜡水化，使用柠檬酸盐缓冲液修复抗原，H2O2孵育，磷酸盐缓冲液冲洗后，取出过氧化物酶，加入Ki-67抗体4℃孵育过夜，再次磷酸盐缓冲液冲洗后，加入二抗，采用SP法进行染色，抗体稀释比例参考说明书建议。染色切片图像使用MC-IDEvaluation7.0图像分析系统分析，随机取5个棕黄色（阳性染色）的视野区，确定标本的阳性染色率，阳性细胞率=阳性染色细胞数目/视野区总细胞数目，取5个视野区的平均值进行分析。(2)UbcH10基因的siRNA序列设计、合成和转染：检索UbcH10基因编码序列区域数据信息，应用siRNA序列序列设计软件构建相应siRNA序列，合成互补双联siR-NA。采用UbcH10-siRNA转染48h,过程严格按照Lipofectmaine2000说明书进行siRNA转染操作。将siRNA试剂干扰后脑胶质瘤组织纳入干扰组。(3)siR-NA干扰后Rb蛋白磷酸化结果检测：取对数生长期细胞，将细胞悬液接种于培养皿中，4ml细胞悬液接种于6cm培养皿中，1d后使用无血清培养稀释携带siRNA的质粒及转染试剂加入细胞中，孵育15min后形成复合物并加入细胞中，6h后换液，2d后检测细胞。

1.3观察指标

对免疫组化结果进行判定，依据阳性细胞率和染色强度对评分进行综合判断。阳性细胞率≥75%记为3分，阳性细胞率在50%～75%记为2分，阳性细胞率在25%～49%记为1分，阳性细胞率<25%记为0分；染色强度：无染色为0分，染色图呈浅棕色为1分，染色图可见明显棕色为2分，染色图可见明显深棕色为3分，两项评分结果相乘作为UbcH10表达总分，UbcH10表达总分<5分为低表达，≥5分为高表达。

1.4统计学方法

应用SPSS22.0统计分析软件处理数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1UbcH10表达水平与一般资料及病理特征的关系

UbcH10表达水平与患者年龄和性别无关（P>0.05);UbcH10表达水平与肿瘤直径、组织学分级、浸润深度、Ki-67表达量、肿瘤转移和生存情况相关（P<0.01）。见表1、表2。

表1UbcH10表达水平与一般资料的关系[例（%）]

2.2shRNA干扰后Rb蛋白磷酸化结果

siRNA干扰后，干扰组UbcH10及p-Rb表达量显著低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.3UbcH10在脑胶质瘤组织及正常组织中的表达情况

脑胶质瘤组织中UbcH10水平（0.91±0.09）较正常组织（0.48±0.10）升高，差异有统计学意义(t=22.37,P<0.01）。

表2UbcH10表达水平与病理特征的关系[例（%）]

表3干扰组和对照组干扰后UbcH10和p-Rb水平比较

3、讨论

脑胶质瘤恶性程度高且预后不良，一直是神经外科的重点和难点。依照WHO病理分类标准，可将胶质细胞瘤分为间变性星形胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤及毛细胞型星形细胞瘤[4]。临床以胶质母细胞瘤最为常见，恶性程度高且预后不良，目前临床治疗主要以放疗、化疗和手术切除为主，但是预后较差。星形胶质细胞瘤浸润性强，由于其与周围组织界限不清，因此，手术无法完全切除，导致术后有较高的复发情况。毛细胞型星形胶质细胞瘤多发于儿童与青年人群，虽然其可经手术完全切除，仍难以有效提高患者的生存时间。WHO病理分级方法主要依靠形态学观察，临床应用仍存在明显不足及局限性，判断其分化过程、与转移瘤的鉴别日益受到人们的重视。

UbcH10是泛素化蛋白降解中的关键成员，其可激活泛素分子后转移至活化酶，将底物泛素化。研究发现，UbcH10水平上调影响多种来源肿瘤细胞的发展过程，因此，通过抑制其表达对调控细胞增殖具有重要作用[5]。据相关文献显示，在多种癌中均可见明显的UbcH10高表达，因此，其在肿瘤发生及发展过程中起到十分重要的角色[6]。基于此，本研究旨在揭示UbcH10在胶质瘤中的功能角色及表达。

本研究结果显示，脑胶质瘤组织中UbcH10水平较正常组织更高，其表达量与肿瘤直径、组织学分级、浸润深度、Ki-67表达量、肿瘤转移和生存情况相关，这证实了UbcH10表达影响脑胶质瘤的发生及发展，有效抑制其表达是治疗脑胶质瘤的关键所在。研究表明，Rb蛋白是公认的抑癌蛋白，能有效减少癌基因表达、转录，但当磷酸化Rb蛋白失活后，会加速细胞周期进程，增强细胞增殖能力[6]。有学者指出，在脑胶质瘤细胞中，UbcH10可磷酸化Rb蛋白[7]。本研究结果显示，shRNA干扰后，UbcH10及p-Rb表达量显著低于对照组。这说明UbcH10能调控Rb蛋白，有效促进转移。

综上所述，UbcH10在在脑胶质瘤细胞中表达水平较高，其表达水平与调控Rb蛋白释放有关，说明其在脑胶质瘤的发生和发展中起到关键性的作用。但由于本研究样本小，还需要进一步研究。

参考文献：

[1]韩丰立,郭微娟.泛素结合酶蛋白在脑胶质瘤细胞中的表达及与细胞周期的关系[J].中国肿瘤临床与康复,2018,25(6):670-674.

[3]冷华平,段永壮,钱华兵,等.MTAP和UbcH10在骨肉瘤中的表达及临床意义[J].癌症进展,2017,15(7):837-839,845.

[4]刘刚,步鹏,韩存芝.胶质纤维酸性蛋白､波形蛋白和细胞角蛋白AE1/AE3在脑胶质瘤和脑转移瘤中的表达及其临床意义[J].肿瘤研究与临床,2018,30(12):834-838.

[5]王朝,李学东.泛素结合酶UBCH10在泌尿系肿瘤中的研究进展[J].医学综述,2020,26(20):4049-4053.

[6]韩丰立,郭微娟.泛素结合酶蛋白在脑胶质瘤细胞中的表达及与细胞周期的关系[J].中国肿瘤临床与康复,2018,25(6):670-674.

[7]林颖,阮海波,叶枫,等.UbcH10在早期子宫颈癌中的表达及临床意义[J].中国妇幼保健,2016,31(7):1522-1526.

黄凌蔚.脑胶质瘤细胞中泛素结合酶10的表达及临床意义[J].慢性病学杂志,2021,22(04):640-641+644.