何首乌为蓼科植物何首乌PolygonummultiflorumThunb.的干燥块根，临床上有生用和制用之分。生首乌具有解毒消痈﹑润肠通便﹑截疟的功效，用于治疗瘰疬疮痈﹑肠燥便秘﹑风疹瘙痒、久疟体虚等证。制首乌具有补肝肾﹑益精血﹑强筋骨﹑乌发、化浊降脂的功效，用于治疗血虚萎黄﹑眩晕耳鸣、腰膝酸软﹑须发早白、肢体麻木、崩漏带下、高脂血症等，临床上常作为补虚药。很多研究认为何首乌属特异质肝损伤，即与个体差异关系密切[1]。何首乌中二苯乙烯苷能够下调葡萄糖醛酸转移酶UDP1A8的表达，导致大黄素的体内蓄积[2]，而细胞实验已有报道，大黄素类成分对人肝L02细胞具有明显的毒性[3]，可见何首乌中很多化学成分存在体内药物–药物相互作用。何首乌不同炮制方法、炮制时间必然引起化学成分组成、比例的变化，而这些成分变化可能导致药物–药物相互作用的变化，对血药浓度产生影响，进而表现出肝损伤，而特异质的肝损伤也可能与不同厂家、不同炮制工艺下生产的制何首乌有关。何首乌的炮制主要是4种方法，即黑豆汁制、黄酒制、清水制、黑豆汁加黄酒制[4,5,6,7]。由于历版《中国药典》均规定何首乌炮制采用黑豆汁制的方法，因此研究黑豆炮制的文献较多[8,9]；并且成分随炮制时间变化规律研究大多以10～30h为主[10]。因此本实验选取4种炮制方法，分别于6、12、18、24、32、36h取样，考察炮制前后、炮制过程中何首乌成分的变化规律。在代谢组学分析方法中，NMR作为应用最广泛的代谢组学技术之一，具有独特的优势，并且主要对植物中的初级代谢产物（相对分子质量低，丰度高的代谢物）进行分析，样品前处理简单方便，高通量，无偏向性，分析速度快等特点[11]。本实验采用基于1H-NMR技术的代谢指纹谱分析方法，结合代谢组学多元统计分析手段，分析何首乌中含量相对较高的成分，确定差异化合物，总结差异化合物随时间变化规律，为何首乌炮制工艺研究提供参考依据。

1、实验材料

BrukerASCEND500MHz超导傅里叶变换核磁共振谱仪（瑞士布鲁克公司）；3K15型高速离心机（Sigma公司）；XW-80A型涡旋混合器（上海沪西分析仪器厂）；；KQ-250E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

重水（D2O,99.9%D）用于锁场（美国剑桥同位素实验室）；TSP[2,2,3,3,-d4-3（三甲基硅基）丙酸钠盐，阿法埃莎化学有限公司]用于化学位移定标及定量分析；超纯水（优级，屈臣氏公司）；磷酸氢二钾（天津市光复科技发展有限公司）；磷酸二氢钠（天津市风船化学试剂科技有限公司）；甲酸（美国ACS恩科化学）、缬氨酸、苏氨酸﹑琥珀酸、γ-氨基丁酸﹑赖氨酸、脯氨酸、苹果酸、胆碱、蔗糖、果糖等均购自上海源叶生物科技有限公司。

首乌药材﹑黑豆均购自于河北省安国药材市场，为蓼科蓼属植物何首乌PolygonummultiflorumThunb.的干燥块根；黑豆加8倍量纯水煮制4h，滤过，豆渣加6倍量纯水，煮约3h，滤过，合并两次滤液，即得黑豆汁[12,13,14]；黄酒为绍兴产传统型干黄酒（绍兴县第三酒厂）。

2、方法与结果

2.1炮制品的制备

称取何首乌生品3.6kg，平均分成4份，每份900g，分别向各样品加入4种液体辅料清水﹑黑豆汁﹑黄酒﹑黑豆汁和黄酒（1∶2.5），固液比为1∶1.2[9]，待完全浸透。何首乌各浸泡品隔水蒸制，并分别于6﹑12﹑18﹑24﹑32﹑36h取样。晾凉后，放入75℃烘箱至完全干透，取出，粉碎，过四号筛（40目），得黑豆汁制、清水制、黄酒制、黑豆汁加黄酒制何首乌各炮制品，实验重复3次。

2.2供试品溶液的配制

精确称取何首乌样品粉末约0.5g，置于15mL离心管中，精密加入60%乙醇水溶液4mL，摇匀10s后，超声提取1.5h,10000r/min离心10min，取上清液，如此重复两次，合并提取液。将所得到的样品溶液精密取出4mL，移到8mL蒸发皿中，并在60℃恒温水浴锅中蒸干。将所得到干燥样品，用600μL0.1mol/LK2HPO4-NaH2PO4(pH7.4）、含有10%重水和0.4mmol/LTSP溶液溶解，涡旋1min,10000r/min离心5min，取上清置5mm核磁管中，测样。

2.3方法学试验

2.3.1精密度试验

黑豆汁制-6h样品连续采集6次1H-NMR谱图，计算δ1.05、1.37、1.96、2.45、3.18、4.69、7.08、8.50特征峰下的化学位移和相对峰面积的RSD值，结果显示：特征峰的化学位移RSD值为0.06%，相对峰面积RSD值为2.14%。

2.3.2稳定性试验

选取黑豆汁制-6h样品在2、4、8、10、12、18、24、36h检测特征峰下的化学位移和相对峰面积，计算其RSD值，结果特征峰的化学位移RSD值为0.04%，相对峰面积RSD值为3.24%。

2.3.3重复性试验

黑豆汁制-6h样品取6份，制备供试品溶液，分别进行1H-NMR测定，计算特征峰相对应的化学位移、相对峰面积，结果特征峰的化学位移RSD值为0.08%，相对峰面积RSD值为4.76%。

2.4基于1H-NMR何首乌炮制样品指纹图谱的化学指认

采用BrukerASCEND500MHz采集1H-NMR谱，反相检测探头（BBI），采集温度为298K,NOESYPR1D脉冲序列。采用预饱和方式压制溶剂峰，从而抑制溶剂信号的检测。循环时间（D1），混合时间（D8）以及90°脉冲时间（P1）分别为2s、0.2s、12.33μs，中心激发频率（O1P）为4.837，预饱和水峰压制功率（PLW9）为31.01dB。采样点数为32k，谱宽（SW）为10.330Hz，扫描次数（NS）为128次。

2D-NMR谱图均采用标准脉冲序列，其中包括COSY(1H-1H相关）、HSQC、（1H-13C直接相关）HMBC(1H-13C远程相关）、TOCSY(1H-1H全相关）、J-RES(J-分辨光谱）。1H-1HCOSY脉冲序列为cosygpmfqf，梯度恢复时间（D16）为0.2μs,F1(1H)和F2(1H)谱宽均为4464.286Hz，采样点数阵为t2×t1=2048×128,NS为128次，2k数据点。HSQC脉冲序列为hsqcetgpsi，其F1(13C)和F2(1H)SW为20831.980、4464.286Hz，弛豫时间为1.457811s，采集时间为0.1188340s，采集数据点阵t2×t1=1024×256,NS为80次，1k数据点。HMBC的脉冲序列为hmbcgpndqf，其F1(13C)和F2(1H)SW为27932.973、4464.286Hz，弛豫时间1.33206403s，采集时间为0.4751860s，预扫描延迟时间为6.50μs，采集数据点阵t2×t1=4096×256,NS为100次，4k数据点。TOCSY脉冲序列为mlevphpp，其F1(13C)和F2(1H)SW均为4464.286Hz，弛豫时间为1.89896500s，采集时间为0.2376180s,D8为0.08s，采集数据点阵t2×t1=2048×256,NS为100次。J-RES的脉冲序列为jresqf，弛豫时间为2s，采集时间为0.1024500s,F1和F2维SW分别为20.000、10000.000Hz，采样数据点阵为t2×t1=2048×256,NS为32次，2k数据点。

何首乌黑豆汁制、黄酒制、黑豆汁加黄酒制、清水制炮制品和生品的核磁共振图谱见图1。可以看出δ0.05～4.00为氨基酸及有机酸区，δ4.00～5.50为碳水化合物区，δ5.50～8.70为芳香区。鉴定代谢产物主要是基于文献报道[15,16,17]、在线数据库（HMDB）和标准品，并结合2DNMR图谱进行分析，共指认出24种化合物，其包括9种氨基酸、8种有机酸﹑4种糖类﹑1种二苯乙烯苷类化合物和2种其他类化合物，见表1。

2.5主成分分析（PCA)

1DNMR、2DNMR图谱预处理使用Topspin(V3.5）软件，包括指数窗函数变换﹑相位校正、基线矫正、化学位移漂移矫正（一般使用TSP）。多元统计分析用1H-NMR数据处理采用MestReNova9.0.1软件，线宽因子设为0.3Hz，自由感应衰变为零填充到64k数据点。除去TSPδ分。积分所得数据进行归一化，并转换为二维矩阵，保存为CSV格式，使用SIMCA-P+(v12.0）软件进0.00～0.02，水峰δ4.65～4.85。核磁共振光谱区以δ0.003积分段对化学位移区间δ0.45～12.50进行分段积行多变量分析，主要通过PCA和OPLS-DA模型进行分析。PCA模型主要看样本间分组趋势以及样本组内的离散程度；在OPLS-DA模型中，主要得到得分散点图和s-plot图。在得分散点图中，每一个点代表不同的样本，以样本类别为变量（Y）建立一个PLS模型，并获得几个与Y不相关的自变量（X）信息并将其替换，从而提高了模型识别能力。其中主要包括R2X,R2Y,Q23个质量评价指标，越接近于1，代表预测的结果真实，模型可靠。在s-plot中，每一个点代表核磁共振光谱区，从而揭示了不同实验方法中的代谢物的显着变化，数据点离中心越远，代表对分组贡献越大。将OPLS-DA模型所给出的每一个变量的VIP值中大于1的变量作为对模型分组贡献最大，并将此数据导出，结合t检验，筛选VIP>1且P<0.05的变量进行分析。

图1何首乌12h下不同炮制品和生品的60%乙醇提取物NMR指纹图谱

将上述所得到的潜在差异代谢物的信息，通过2DNMR谱图，数据库（HumanMetabolomeDatabase）检索，以及加入标准品等方法进行结构鉴定。PCA分析是一种无监督的模式识别方法，是在样品分组信息未知的情况下进行的聚类分析，它能够将具有相关关系的p个变量转变为q(p

以何首乌炮制12h为例，制作PCA分析的得分图（Scoreplot），见图2。PCA结果表明，何首乌生品组与各炮制品分组明显，但各个炮制品组较为接近，因而接下来利用正交偏最小二乘–判别分析进行分组比较分析。

表1何首乌60%乙醇提取物核磁鉴定结果

2.6正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA)

OPLS-DA是一种有监督模式识别方法，是利用它们已知分组变量后再寻找组间的差异。它是将PLS-DA与正交信号校正分析方法联系起来，从而使不同组别间的差异最大地显现出来。为进一步寻找何首乌炮制前后的变化以及炮制时间的影响，本实验采用OPLS-DA统计分析模型寻找何首乌不同炮制品中差异性化学成分，并利用得分图、VIP和p-value找出何首乌不同炮制品组间差异化合物，结果见图3、4。

图2基于NMR何首乌炮制12hPCA的Scoreplot图

图3炮制6h(A）、12h(B）、18h(C）、24h(D）、32h(E）、36h(F）何首乌炮制品和生品的OPLS-DA图

图4不同炮制时间黑豆汁制（A）、黄酒制（B）、黄酒加黄酒制（C）和清水制（D）何首乌和生品的OPLS-DA图

2.7基于1H-NMR差异化学成分鉴定结果

采用OPLS-DA分析中的VIP值（VIP>1）作为筛选何首乌不同炮制品间含量差异较大的化学成分，并根据候选差异化学成分在NMR数据中的相对峰面积进行t检验，选择P<0.05作为生物标记物，共得到15种生物标志物，大部分为初级代谢产物，少数次级代谢产物，结果见表2。

2.8基于1H-NMR何首乌不同炮制方法及炮制时间之间的比较

针对找到的15种差异化学成分，利用半定量分析方法，以相对峰面积作为化合物半定量的衡量标准，样品中所含TSP作为内标，计算每一个差异化学成分的质量分数，与未炮制组相比，炮制后何首乌中化学成分含量变化的大致趋势如下：在同一炮制时间下，何首乌炮制后化学成分质量分数升高的有苏氨酸、脯氨酸、没食子酸、β-葡萄糖、琥珀酸、乳酸、胆碱；质量分数降低的有乙醇、γ-氨基丁酸、蔗糖；缬氨酸、乙酸、丙氨酸、甘氨酸等代谢物在黑豆汁加黄酒制、黄酒制中含量升高，在黑豆汁制、清水制中含量降低；二苯乙烯苷在何首乌炮制6h,4种炮制品中质量分数比未炮制品高，延长炮制时间，4种炮制品中二苯乙烯苷的质量分数均低于何首乌生品。

比较何首乌不同炮制时间下差异化学成分的含量变化，共有6个炮制时间，分别为6、12、18、24、32、36h。将得到差异化学成分的质量分数结果导入到GraphPad5.0软件中以折线图表示，结果见图5。

表2基于NMR何首乌炮制后差异化合物

图5基于NMR何首乌中差异代谢物随炮制时间的变化

4种炮制方法随着炮制时间的延长，何首乌中化学成分质量分数变化具有升高趋势的有没食子酸、乳酸、脯氨酸、β-葡萄糖、苏氨酸、胆碱、甘氨酸、琥珀酸；质量分数变化具有降低趋势的是蔗糖、γ-氨基丁酸等；质量分数变化具有先升高后降低趋势的是二苯乙烯苷；先降低后升高的是乙醇、醋酸乙酯、缬氨酸、丙氨酸。

3、讨论

采用1H-NMR植物代谢组学技术对何首乌炮制样品中差异代谢物进行分析比较。利用2DNMR图谱、在线数据库（HMDB）、标准品共鉴定出24种化合物；利用多变量分析方法（OPLS-DA）共筛选出15种差异化学成分，其中大部分成分为初级代谢产物。

根据定量分析方法，比较不同炮制方法在不同炮制时间下差异化合物含量变化，其中何首乌炮制后苏氨酸、脯氨酸、没食子酸、β-D-葡萄糖、琥珀酸、乳酸、胆碱、甘氨酸含量具有升高趋势；γ-氨基丁酸、蔗糖具有降低的趋势；二苯乙烯苷的含量是先升高后降低；先降低后升高的是乙醇、醋酸乙酯、缬氨酸、丙氨酸。以上结果表明不同炮制方法、炮制时间均对何首乌中化学成分具有显著的影响，但变化成分与肝毒性之间的关联有待进一步研究，如二苯乙烯苷的含量变化规律为先升高后降低，而有文献报道二苯乙烯苷可以与蒽醌类成分发生药动学上的药物相互作用[18]，这可能与何首乌特异质肝损伤的发生有关系。

参考文献：

[4]顾蘅,张毅.何首乌炮制方法古今研究[J].中医临床研究,2015,7(34):24-26.

[5]张英华,胡馨,王平,等.何首乌炮制工艺的研究[J].中成药,2005,27(8):916-919.

[6]李林福,刘振丽,宋志前,等.何首乌炮制研究进展[J].中国药房,2007,18(30):2377-2379.

[7]张庆华,易炳学.何首乌炮制研究进展[J].中国中医药信息杂志,2014,21(3):132-136.

[8]应久皓,黄德杰,徐子诚,等.何首乌炮制工艺的研究[J].中成药,1985(11):1270-1273.

[9]廖传荣.何首乌炮制工艺研究[D].长沙:湖南农业大学,2016.

[10]丘小惠,马兴田,闵江,等.何首乌炮制工艺的研究[J].中国药房,2006,17(16):1270-1273.

[12]周滢,罗承娟,邓中甲.何首乌炮制历史沿革研究[J].中国医药导报,2010,7(10):9-10,38.

[13]蒋纪洋,高占秀,徐淑云.何首乌古今炮制研究[J].时珍国药研究,1997(4):350-352.

[14]陈艳,李飞,杨蕾.加热时间对何首乌中蒽醌类成分的影响[J].北京中医药大学学报,2004,27(2):80-82.

[15]张彩云.基于植物代谢组学技术的何首乌质量评价研究[D].广州:广东药科大学,2016.

[16]吴香玉.绿豆萌发的动态代谢组学研究[D].武汉:中国科学院武汉物理与数学研究所,2014.

王健,孙瑜,陈莉莉,韩真真,孙精通.基于~1H-NMR代谢组学技术评价何首乌炮制品中差异代谢物的研究[J].现代药物与临床,2020,35(08):1537-1543.