肉苁蓉为列当科肉苁蓉属多年生寄生植物，生长在沙地环境，有“沙漠人参”的美称。《神农本草经》《药性论》《本草疏经》均记载其具有补肾壮阳的功效，作为药物使用的历史悠久。随着现代医药技术发展，肉苁蓉药用活性成分逐渐被发现，检测分析方法逐渐丰富[1,2],其活性成分主要包括苯乙醇苷类、多糖类、环烯醚萜类、生物碱、木质素类和挥发性成分等[3,4,5]。现代药理学研究表明，肉苁蓉活性成分还涉及润肠通便、缓解体力疲劳、保肝护肝、抗衰老、改善记忆力、抗氧化、抗癌等诸多功效[6,7,8,9,10]。因为肉苁蓉具有多重功效，围绕其功能开发的产品日益增多，且逐渐被广泛认知和被接受，摄入含有肉苁蓉活性成分产品的频率及人群也相应增加，其食用安全性问题备受关注。已有研究证实肉苁蓉明显毒副效应[11,12],且无遗传毒性，但有关肉苁蓉致畸性毒性的证据较少。本文旨在通过动物实验，在器官形成关键期给予受孕大鼠肉苁蓉，观察其是否有致畸作用，为相关产品开发及安全食用提供依据。

一、材料和方法

1.主要试剂：

肉苁蓉干膏粉[人体每日推荐量1000 mg/(60 kg·BW)]、茜素红(IND)、甘油(AR)、2,4,6-三硝基酚(AR)、氢氧化钾(AR)、甲醛溶液(AR)、冰乙酸(AR)。

2.主要仪器：

ACS-3kg型电子秤、JJ500型电子天平、LEICA S6E型体视显微镜、解剖器械。

3.动物及饲养：

性成熟SD大鼠，雄性50只，雌性100只(未孕未产，初始体重298～313 g),购自四川省中医药科学院实验动物中心，生产许可证号SCXK(川)2018-19.SPF级。饲养在环境条件进行控制的屏障环境中(许可证号：SYXK[川]2016-043.屏障系统),动物饲养间温度控制在20～25℃,相对湿度控制在40%～70%。饲料为大鼠繁殖饲料，购自邳州市小河科技发展有限公司，生产许可证号苏饲证(2019)03058,饲料营养成分符合GB 14924.3-2010要求。动物自由饮水，饮水为灭菌自来水，自来水成分符合生活饮用水卫生标准GB 5749-2006。

4.剂量设计：

根据90 d经口毒性实验未观察到有害作用水平(5000 mg/kg体重),试验设1250 mg/kg、2500 mg/kg和5000 mg/kg体重三个剂量组，同时设阴性对照组(蒸馏水)和阳性对照组(环磷酰胺，15 mg/kg体重)。配置时，分别称取31.25 g、62.5 g、125 g受试物各加蒸馏水至250 ml。环磷酰胺临用时现配，称取187.5 mg加蒸馏水至25 ml。

5.试验方法：

雌雄SD大鼠按1︰2合笼，次日检查阴栓，查见阴栓则认为交配成功，查见阴栓当天为妊娠第0天，此后1 d为第1天。采用完全随机法将交配成功的雌鼠分为5组，每组至少18只。妊娠第6～15天，各剂量组以10 ml/kg经口灌胃给予受试物溶液、阴性对照组给予相同体积蒸馏水，阳性组于孕第12天按2 ml/kg体重腹腔注射环磷酰胺1次。妊娠第0、6、9、12、15、20天称量体重，调整灌胃量。妊娠第20天，孕鼠称重后行安乐死，取出子宫，称子宫连胎鼠总重，摘除卵巢称重并计数黄体数，剖开子宫记录总着床数、活胎数、死胎数、吸收胎数，取出活胎仔称重、量体长、逐个检查外观，取下胎盘称重。将1/2活胎鼠放入鲍氏液中固定两周后检查脏器发育情况，其余胎鼠去内脏后经固定、染色、透明后以检查骨骼发育情况。

6.统计学处理：

应用SPSS 16.0软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差

表示，使用Shapiro-Wilk检验对各组数据进行正态性检验，对满足正态分布的数据进行方差齐性检验，若数据呈正态分布且方差齐，组间比较采用方差分析，Dunnett法进行两两比较；若数据呈非正态分布，组间比较采用Kruskal-Wallis检验，Dunnett's T3法进行两两比较。发生率以构成比[n(%)]表示，比较采用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

二、结果

1.SD孕鼠体重：

第6、9、12、15天孕鼠体重数据呈正态分布且方差齐，采用方差分析；第0、20天孕鼠体重和体重增重不满足正态性要求，孕鼠净增重数据不满足方差齐性要求采用Kruskal-Wallis检验。第0天(χ2=5.664,P=0.227)、6天(F=0.906,P=0.464)、9天(F=1.098,P=0.363)、12天(F=1.081,P=0.371)、15天(F=0.627,P=0.644)孕鼠体重和体重净增重(χ2=5.790,P=0.215)组间差异无统计学意义。第20天孕鼠体重(χ2=12.283,P=0.015)和体重增重(χ2=24.485,P=0.000)组间差异有统计学意义。环磷酰胺组第20天孕鼠体重显著低于2500 mg/kg和5000 mg/kg体重组(P=0.045,0.008),环磷酰胺组孕鼠增重显著低于阴性对照组和剂量组(P=0.000、0.000,0.000、0.000)。各剂量组第20天体重及体重增重与阴性对照组比较，差异无统计学意义(P=1.000、1.000、1.000,0.670、0.518、0.340)。见表1。

表1 SD孕鼠体重

2.胎仔发育情况：

窝平均活胎数、着床数、黄体数、胎仔平均体重、胎仔平均身长数据均不满足正态性要求，采用Kruskal-Wallis检验。窝平均活胎数(χ2=1.869,P=0.760)、黄体数(χ2=6.230,P=0.183)、吸收胎发生率(χ2=1.109,P=0.894)组间差异无统计学意义。着床数(χ2=9.964,P=0.041)、胎仔平均体重(χ2=48.968,P=0.000)、胎仔平均身长(χ2=48.264,P=0.000)、死胎发生率(χ2=196.912,P=0.000)组间差异均有统计学意义，但各剂量组着床数与阴性对照组和环磷酰胺组比较，差异无统计学意义(P=1.000、1.000、0.592,0.293、0.111、0.702)。环磷酰胺组死胎发生率显著高于阴性对照组及各剂量组(P=0.000、0.000、0.000、0.000),胎仔平均体重(P=0.000、0.000、0.000、0.000)、胎仔平均身长(P=0.000、0.000、0.000、0.000)均显著低于阴性对照组及各剂量组。胎仔平均体重、胎仔平均身长、死胎发生率与阴性对照组差异无统计学意义(P= 0.553、0.389、0.193,0.928、0.650、0.518,0.758、0.221、0.863)。见表2。

3.胎仔外观检查：

环磷酰胺组外观畸形窝发生率、脑膨出、脑积水、脐疝、腹裂、无指、并指和短指发生率分别为100.0%、83.2%、1.2%、0.4%、0.4%、2.8%、5.2%和2.0%,外观畸形窝发生率、脑膨出发生率、无指及并指发生率显著高于对照组(χ2=38.000、328.354、6.253、11.765,P=0.000、0.000、0.016、0.001)。2500 mg/kg体重组观察到1例短指，1250 mg/kg和5000 mg/kg体重组及对照组未观察到外观畸形。外观畸形窝发生率、短指发生率组间差异无统计学意义(χ2=2.793、2.784,P=1.000、0.732);2500 mg/kg体重组与对照组比较，外观畸形窝发生率、短指发生率差异无统计学意义(χ2=0.974、0.882,P=1.000、1.000)。见表3。

4.胎仔骨骼发育检查：

环磷酰胺组骨骼畸形窝发生率、头顶间骨缺损、头顶间骨发育不全、后头骨缺损、后头骨发育不全、胸骨缺损、胸骨发育不全、分叉肋、短肋、缺肋、肋骨中断、脊柱骨裂开、脊柱骨发育不全、四肢骨数目异常、趾骨异常、腕骨骨化不全发生率分别为100%、66.7%、33.3%、76.7%、23.3%、32.5%、66.7%、3.3%、19.2%、45.8%、51.7%、0.8%、12.55%、98.3%、0.8%和7.5%,除分叉肋、脊柱骨裂开、趾骨异常发生率外，其余观察指标差异均有统计学意义。阴性对照组及各剂量组均观察到胸骨骨化不全，未观察到其它类型骨骼发育异常现象。阴性对照组、1250 mg/kg、2500 mg/kg和5000 mg/kg体重组胸骨骨化不全发生率分别为15.2%、21.3%、20.0%和25.0%,组间差异无统计学意义(χ2=3.421,P=0.332)。各剂量组胸骨骨化不全发生率与阴性对照组比较差异均无统计学意义(χ2=1.380、0.869、3.361,P=0.240、0.351、0.067)。见表4。

5.胎仔内脏发育情况：

环磷酰胺组内脏畸形窝发生率、侧脑室扩张、第三脑室扩张、马蹄肾、肾缺失发生率分别为66.7%、2.3%、5.4%、2.3%和2.3%,其中内脏畸形窝发生率及第三脑室扩张发生率显著高于阴性对照组(χ2=18.000、6.374,P=0.000、0.015)。在阴性对照组和各剂量组未观察到胎仔内脏发育异常。见表5。

表2胎仔发育情况

表3 SD大鼠胎仔外观检查[n(%)]

三、讨论

环磷酰胺组孕鼠增重、胎仔平均体重及平均身长显著低于阴性对照组，死胎发生率、外观畸形、骨骼畸形及内脏畸形窝发生率显著高于阴性对照组，提示试验系统及操作可靠。

试验期间，阴性对照组及剂量组孕鼠中未观察到明显中毒症状，未出现死亡；孕期体重持续增长，孕早中晚期体重及体重增重和体重净增重组间差异无统计学意义，且各剂量组与阴性对照组比较无显著差异，提示肉苁蓉干膏粉对孕鼠无明显母体毒性。总着床数无显著差异，提示对胚胎定植过程无有害作用。吸收胎发生率、死胎发生率、胎鼠平均体重和胎鼠平均身长无显著差异，提示该受试物对胚胎发育及胎仔生长无明显抑制作用。外观检查仅在2500 mg/kg体重组观察到1例短指，未观察到脑膨出、脊柱裂、短肢、腹裂等严重外观异常，且外观异常组间差异无统计学意义，尚不能认为肉苁蓉会导致胎仔外观异常发生率升高。胎鼠骨骼检查中最常见异常为胸骨骨化中心缺失(尤其第二和第五胸骨)和骨化不全。本次研究在各组均观察到胸骨骨化不全，但发生率组间差异无统计学意义，且各组与对照组比较无显著差异，尚不能认为肉苁蓉干膏粉导致胎仔胸骨骨化不全发生率升高。脏器检查未见明显异常。

传统医学中，肉苁蓉被认为是补肾壮阳佳品，其可通过促进激素分泌起到保护生精功能和精子质量的作用，可促进生殖[13]。中医临床上被用于治疗少精症、弱精症等，也被用于治疗妇科疾病如不孕、多囊卵巢综合症等[14]。除治疗作用外，还具有缓解体力疲劳、抗氧化、润肠通便和改善记忆力等保健功能，因此其在保健食品中有广阔的应用前景[15],同时应用安全性问题成为首要问题。现有有关肉苁蓉毒性研究(急性毒性、遗传毒性、亚急性毒性及亚慢性毒性)均显示未观察到明显毒效应[16,17]。林健[18]等将肉苁蓉研磨制成的粉末按830、1660、3330 mg/kg体重于孕6～15 d经口灌胃给予SD大鼠以观察肉苁蓉的致畸性，结果未观察到明显生殖或致畸性毒性。本研究所用受试物为肉苁蓉提取物浓缩后制成的粉末，其活性成分含量可能高于林健的研究；且根据90 d经口毒性试验结果，最高剂量设为5000 mg/kg体重，递减设为2500 mg/kg和1250 mg/kg体重，于SD大鼠孕6～15 d经口灌胃给予受孕大鼠，并设置了阳性对照组，结果未观察到与受试物相关的母体生殖毒性、胎仔外观、骨骼及脏器异常。本研究以相对较高的剂量观察了肉苁蓉的致畸毒性，得到与既往研究一致的结果，进一步证实了肉苁蓉无致畸毒性。

表4胎仔骨骼发育检查[n(%)]

表5胎仔内脏发育情况[n(%)]

综上，在本实验条件下，肉苁蓉干膏粉无母体毒性，对SD大鼠胎仔发育无抑制作用，无致畸性毒性作用，不引起致畸作用NOAEL值为5000 mg/kg体重。

参考文献:

[1]刘杰,卢鹏飞,盛晋华,等.三种工艺提取肉苁蓉浸膏中四种主要有效成分含量的差异[J].北方园艺,2015(22):160-163.

[2]杨国斌,韩玲,余群力,等.提取和干燥方式对肉苁蓉提取物中有效成分的影响[J].食品与发酵工业,2023,49(18):250-258.

[3]王利,松伟,刘小雪,等.肉苁蓉生物活性成分及功效的研究进展[J].食品科技,2023,48(2):208-214.

[4]毕萃萃,刘银路,魏芬芬,等.肉苁蓉的主要化学成分及生物活性研究进展[J].药物评价研究,2019,42(9):1896-1900.

[5]郭丁禹,肖井雷.肉苁蓉功能性成分质量控制和生物活性研究进展[J].吉林中医药,2023,43(7):861-864.

[6]李莹曼,宋紫腾,侯淇允,等.基于抗氧化谱效关系的肉苁蓉质量标志物研究[J].中国现代中药,2024,26(2):265-275.

[7]杨胜杰,刘明川,杨进平,等.管花肉苁蓉提取物通便作用的实验研究[J].北方药学,2019,16(8):128-130.

[8]武改红,王雪峰,王军,等.肉苁蓉提取物及其在化妆品中的美白抗衰机制研究进展[J].日用化学品科学,2023,46(8):35-38+64.

[9]张佳佳.蒙药肉苁蓉的药理作用及临床应用研究[J].中国民族医药杂志,2022,28(5):53-55.

[10]王璐,吴丽娥,贾建新.肉苁蓉的药理作用及其在中枢神经系统疾病中的研究进展[J].中华中医药学刊,2024,42(3):50-54.

[11]张亚安,闫翠敏,傅岩,等.复方管花肉苁蓉片毒理安全性研究[J].化工时刊,2019,33(10):32-35+60.

[12]白国辉,张晓丽,曲琳,等.肉苁蓉急性毒性和90d喂养实验毒性研究[J].包头医学院学报,2016,32(9):25-26.

[13]刘忠平,李质馨,田洪艳,等.肉苁蓉对生殖系统影响的研究进展[J].上海中医药杂志,2015,49(12):84-86.

[14]张湘苑,于同月,赵林华.肉苁蓉的临床应用及其用量探究[J].吉林中医药,2022,42(8):966-969.

[15]冯朵,段昊,吕燕妮,等.肉苁蓉在我国保健食品中的应用[J].食品科技,2021,46(12):76-81.

[16]蒋中仁,徐薇,刘科亮,等.管花肉苁蓉提取物对SD大鼠的亚慢性毒性研究[J].预防医学情报杂志,2013,29(4):315-318.

[17]李敏杰,田峰,杜军,等.管花肉苁蓉提取物急性毒性､遗传毒性及亚慢性毒性试验研究[J].毒理学杂志,2013,27(5):400-403.

[18]林健,林蔚,钟礼云,等.肉苁蓉对大鼠生殖毒性及致畸的研究[J].医学动物防制,2016,32(4):393-395.

文章来源:蒋勇,敬明武.肉苁蓉干膏粉致畸性毒性实验研究[J].齐齐哈尔医学院学报,2024,45(13):1224-1229.