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UPLC-MS/MS同法测定熥敷颈腰痛酊中9个有效成分的含量

2024-07-02 16 上传者：管理员

摘要：目的:建立一种同时测定熥敷颈腰痛酊中大豆苷元、芒柄花黄素、芫花素、槲皮素、芦丁、芹菜素、山柰酚、木犀草素、葛根素含量的超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)。方法:采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8μm),以0.1%甲酸水溶液为流动相A,甲醇为流动相B,梯度洗脱，流速为0.3 mL·min-1,柱温为45℃,进样量为2.0μL;电喷雾(ESI)离子源，正、负离子模式多反应监测采集。结果:芹菜素、芫花素、大豆苷元在0.2～1 000 ng·mL-1范围内线性良好，葛根素、芦丁、木犀草素、山柰酚、芒柄花黄素在0.2～2 000 ng·mL-1范围内线性良好，槲皮素在1.0～5 000 ng·mL-1范围内线性良好；分离度较好，精密度、重复性、重现性、稳定性试验RSD均小于5%(n=6);平均加样回收率在82.7%～111.8%,RSD为2.0%～5.4%(n=6)。6批熥敷颈腰痛酊中大豆苷元、芒柄花黄素、芫花素、槲皮素、芦丁、芹菜素、山柰酚、木犀草素、葛根素的含量范围分别为8.46～17.97μg·mL-1、0.62～1.67μg·mL-1、0.03～0.08μg·mL-1、1.34～2.22μg·mL-1、0.70～1.14μg·mL-1、0.48～0.99μg·mL-1、0.20～0.90μg·mL-1、0.10～0.16μg·mL-1、167.95～227.75μg·mL-1。结论:本方法专属性强，线性范围宽，准确高效，可同时对熥敷颈腰痛酊中9个有效成分进行含量检测，为该方建立有效的质量控制方法。

关键词：
含量测定
活性成分
液质联用
熥敷颈腰痛酊
超高效液相色谱串联质谱法
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熥敷颈腰痛酊是甘肃省名中医赵继荣教授的经验效方，是由伸筋草、透骨草、威灵仙、葛根等8味药物经酊剂之浸渍法制备而成的外用制剂，方中伸筋草、透骨草为君药，以舒筋通络、活血止痛，两药相须为用增强彼此疗效；威灵仙、木瓜、桂枝、葛根共为臣药，威灵仙和木瓜祛风湿、通经络，桂枝温经通络、散寒止痛，葛根解肌舒筋止痛，桂枝与葛根相配伍，表里同治、寒温相合，温通筋脉，解肌养筋；红花、鸡血藤为佐药，补血活血、通络止痛。以上诸药合用，共奏温经通络、舒筋活血、散寒止痛的之功效[1]。

既往研究表明，伸筋草乙醇、正丁醇、三氯甲烷提取物抗炎镇痛作用良好，可降低佐剂性关节炎大鼠血清中白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)的水平[2]。申鸽等[3]的动物实验研究发现，珍珠透骨草醇提取物通过多组分、多靶点联合发挥抗炎活性。威灵仙中槲皮素、山柰酚、芦丁等多种化合物具有抗炎、抗氧化、镇痛的药物作用[4]。葛根中的葛根素、大豆苷元对神经组织损害和炎症导致的神经性疼痛具有缓解作用，抑制IL-1、IL-6和TNF-α的表达，减轻大鼠背根神经节引起的机械痛觉敏化[5]。桂枝醇提物具有较好的抗炎活性，木瓜中芦丁、槲皮素、山柰酚通过抑制Akt/NF-κB信号通路激活及促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α生成发挥抗炎镇痛活性[6,7]。鸡血藤中的儿茶素、芒柄花黄素具有抗炎、保护血管、改善血液流速的药理作用，红花中的山柰酚、芫花素、姜黄素等通过抑制一氧化氮(NO)的释放而起到抗炎活性[8,9]。综上可知，熥敷颈腰痛酊药物组成中所含共有化合物槲皮素、山柰酚、芒柄花黄素、芦丁等具有广泛的抗炎、镇痛、抗氧化、保护血管、抑制神经病理性疼痛的作用，其机制可能是多药物、多途径、多靶点共同起效，因此值得进一步研究。2020年版《中华人民共和国药典》中关于伸筋草、透骨草等中药的质量控制仅限于高效液相色谱法，但该法的专属性及灵敏性不及液质联用技术[10,11]。本课题组前期研究表明，“熥敷系列”中成药能够改善腰椎间盘突出症患者腰腿疼痛症状，降低炎性指标水平，提高生活质量，其功效为活血化瘀、温通经络、抗炎镇痛，但对其有效成分和作用机制尚未研究[12,13,14]。故此，本研究采用UPLC-MS/MS同时测定熥敷颈腰痛酊中9个化学成分的含量，旨在为该制剂的质量控制提供方法学参考，为中药酊剂的开发研究提供借鉴。

1、材料

1.1 仪器

ACQUITY UPLC I-Class超高液相色谱仪、XEVO TQ-XS串联四极杆质谱系统、Masslynx质谱数据采集软件(Waters公司),Mikro 220R台式高速冷冻离心机(Hettich科学仪器公司),Vortex 2涡旋混匀仪(IKA集团),ME55/155DU十万分之一电子分析天平(METTLER TOLEDO科技有限公司),KQ3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂及试药

对照品大豆苷元(含量99.99%,批号MUST-22101117)、芒柄花黄素(含量99.03%,批号MUST-23033005)、芫花素(含量98.80%,批号MUST-23061014)、槲皮素(含量98.85%,批号MUST-23042008)、芹菜素(含量98.12%,批号MUST-22120111)、山柰酚(含量99.99%,批号MUST-23030915)购于成都曼思特生物科技有限公司；对照品芦丁(含量≥98%,批号MUST-22039021)、木犀草素(含量≥98%,批号MUST-23010018)、葛根素(含量≥98%,批号MUST-22110405)购于中国食品药品检定研究院；色谱级甲酸和甲醇购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司，超纯水(杭州娃哈哈集团有限公司);熥敷颈腰痛酊样品(甘肃省中医院药学部，批号20220101、20220301、20220701、20221001、20230101、20230401)。

2、方法与结果

2.1 色谱条件

采用Waters ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱系统，色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),以0.1%甲酸水溶液为流动相A,甲醇为流动相B,梯度洗脱(0～1 min, 80%A;1～11 min, 80%A→0%A;11～15 min, 0%A;15～15.1 min, 0%A→80%A;15.1～17 min, 80%A),流速为0.3 mL·min-1,柱温为45 ℃,进样量为2.0 μL。

2.2 质谱条件

采用Waters XEVO TQ XS串联四极杆质谱系统，电喷雾离子源，正、负离子模式多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)采集，正离子离子源电压为3.0 kV,负离子离子源电压为2.0 kV,去溶剂温度为550 ℃,去溶剂气体流速为1 000 L·h-1,锥孔气体流速为150 L·h-1。各成分的质谱采集参数见表1。

表1 熥敷颈腰痛酊中9个被测定成分的质谱检测参数

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液

精密称取大豆苷元、芒柄花黄素、芫花素、槲皮素、芦丁、芹菜素、山柰酚、木犀草素、葛根素的对照品各10 mg, 分别置于10 mL量瓶中，加甲醇-水(1∶1)5 mL充分溶解，定容至10 mL,制成质量浓度分别为1.12、1.07、0.98、1.05、0.96、1.01、1.14、0.94、1.02 mg·mL-1的对照品储备液。取上述对照品储备液各1 mL,置于同一20 mL量瓶中，加50%的甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，得到大豆苷元、芒柄花黄素、芫花素、槲皮素、芦丁、芹菜素、山柰酚、木犀草素、葛根素的质量浓度分别为56.00、53.50、49.00、52.50、48.00、50.50、57.00、47.00、51.00 μg·mL-1的对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液

精密量取100 μL样品，置于1.5 mL离心管中，加入甲醇-水(1∶1)900 μL,涡旋混匀10 min后，在4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min。再用移液枪移取100 μL上清，置于1.5 mL离心管中，加入甲醇-水(1∶1)700 μL,涡旋混匀10 min后，在4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min。取上清液200 μL,置于带250 μL内插管的进样瓶中，进行质谱检测。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性

精密吸取“2.3.1”项下配制的对照品溶液和“2.3.2”项下制备的供试品溶液、50%甲醇水溶液分别进样，色谱图见图1,各成分均未检测到干扰性成分，表明该方法专属性良好。

图1 对照品溶液(A)和供试品溶液(B)的MRM质谱图

2.4.2 线性关系考察

精密吸取“2.3.1”项下配制的对照品溶液，逐级稀释，以S/N=10时被测定成分的浓度为定量限(LOQ),S/N=3时被测定成分的浓度为检测限(LOD)。依次进样，以各成分的质量浓度X为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，结果见表2,各成分的线性关系良好。

2.4.3 精密度试验

精密吸取“2.3.1”项下配制的中浓度(100 ng·mL-1)的对照品溶液，连续进样6次，测得大豆苷元、芒柄花黄素、芫花素、槲皮素、芦丁、芹菜素、山柰酚、木犀草素和葛根素峰面积的RSD分别是0.63%、0.40%、1.2%、1.4%、1.3%、1.3%、13%、0.66%、0.59%,RSD均小于2%,表明该方法具有良好的精密度。

2.4.4 重复性试验

取同一批号(20220101)样品6份，按“2.3.2”项方法配制供试品溶液，依次进样，计算得大豆苷元、芒柄花黄素、芫花素、槲皮素、芦丁、芹菜素、山柰酚、木犀草素和葛根素的平均含量分别为15.32、1.48、0.06、1.52、0.78、0.80、0.66、0.14、196.79 μg·mL-1,各成分RSD分别为0.51%、1.4%、3.6%、4.0%、1.9%、2.1%、3.1%、1.6%、0.77%,RSD均小于5%,表明该方法具有良好的重复性。

2.4.5 稳定性试验

取同一批号(20220101)样品6份，按“2.3.2”项方法制备供试品溶液，等分为6份，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h后测定，记录峰面积，计算得大豆苷元、芒柄花黄素、芫花素、槲皮素、芦丁、芹菜素、山柰酚、木犀草素和葛根素峰面积的RSD分别为0.42%、0.76%、2.2%、4.3%、1.7%、1.8%、1.0%、1.2%、0.92%,RSD均小于5%,表明供试品溶液于室温下放置24 h内保持稳定。

2.4.6 加样回收率试验

精密量取已知目标成分含量的熥敷颈腰痛酊样品溶液6份，按照目标成分约100%的含量精密加入相应质量的对照品溶液，按照“2.3.2”项方法制备供试品溶液并进行测定，记录峰面积。计算加样回收率及RSD,结果见表3,平均回收率范围为82.7%～111.8%,RSD<6%,表明该方法准确。

2.5 样品含量测定

取6批样品，分别按“2.3.2”项方法制备供试品溶液并进行测定，记录峰面积，计算各成分含量，结果见表4。

表2 熥敷颈腰痛酊中9个成分的线性关系方程和定量限、检测限

表3 熥敷颈腰痛酊中9个成分加样回收率试验(n=6)

3、讨论

3.1 检测技术的选择

HPLC法是药物制剂成分测定的常用方法，但对于多组分的制剂检测，同时检测的难度较大，需要使用DAD二极管阵列检测器筛选各自合适的检测波长，早年质谱前端连接的都是HPLC,但近些年发现UPLC有更好的分离效果，更适合作为质谱前端的分离设备[15]。预试验阶段曾尝试以HPLC法对熥敷颈腰痛酊进行定量分析，结果发现复方中各成分含量差异较大，究其原因为HPLC法无法达到同法检测，因此采用分离能力高、选择能力强、灵敏度精准的UPLC-MS/MS技术进行筛选、检测[16]。

表4 熥敷颈腰痛酊中9个成分的含量测定结果

3.2 提取方法的选择

实验过程中将熥敷颈腰痛酊样品分别稀释10、50、80、100和150倍后上机检测，最后发现80倍浓度时所有待测成分都能够在各自的线性范围内显示，所以对熥敷颈腰痛酊样品的提取方法规定为以50%的甲醇水溶液稀释至80倍浓度。

3.3 检测参数的设置

测试过程中对流动相梯度进行了优化，结果表明梯度条件甲醇从20%升高到100%的时间越长，各色谱峰的分离会越好，但是槲皮素和芦丁2个成分在各种时间的梯度洗脱下都难使其保留时间分离，由于使用的是质谱检测，保留时间虽然区分不开，但是2个成分的检测离子对不同：槲皮素是302.954>69.019,芦丁是611.332>303.352,2个成分的提取离子流图不互相干扰，因此2个成分的含量测定不受影响。检测结果中，样品批号20220101和20220301结果较为相似，批号20220701和20221001结果较为相似，20230101和20230401结果较为相似，这可能与熥敷颈腰痛酊中各中药原料原产地、采收季节和炮制工艺的差异有关。

3.4 小结

本研究建立的同时测定熥敷颈腰痛酊中9个成分大豆苷元、芒柄花黄素、芫花素、槲皮素、芦丁、芹菜素、山柰酚、木犀草素、葛根素的UPLC-MS/MS方法，具备简单易操作，准确效率高，专属性强，精密度重复性好，可作为熥敷颈腰痛酊质量评价参考。

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