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人参皂苷Rg1抑制舌鳞状细胞癌增殖和转移能力的作用机制研究

2024-07-09 16 上传者：管理员

摘要：目的研究人参皂苷Rg1(GS-Rg1)抑制舌鳞状细胞癌(TSCC)增殖和转移能力的作用，以及相关的作用机制。方法用1.25、2.5、5.0和10.0μmol·L-1的GS-Rg1处理TSCC细胞CAL-27 48 h后，用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测不同浓度细胞的增殖能力，并计算GS-Rg1作用CAL-27 48 h的IC50值。TSCC细胞CAL-27分为对照组和GS-Rg1组，分别用0.9%NaCl和IC50浓度的GS-Rg1处理对照组和GS-Rg1组48 h。用流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况，用Transwell实验检测各组细胞转移能力。构建TOP/FOP Flash质粒，转染对照组和GS-Rg1组，用荧光素酶实验检测GS-Rg1对TSCC细胞CAL-27中wnt/β-连环蛋白(wnt/β-catenin)信号通路活性的影响。用wnt/β-catenin通路抑制药XAV939处理GS-Rg1组细胞(XAV939+GS-Rg1组),及wnt/β-catenin通路激活药HLY78处理GS-Rg1组细胞(HLY78+GS-Rg1组),检测GS-Rg1组、XAV939+GS-Rg1组和HLY78+GS-Rg1组细胞中wnt/β-catenin信号通路活性、细胞增殖能力、细胞周期分布以及转移能力变化，用蛋白质印迹法检测各组细胞中wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin及其下游细胞周期相关分子细胞性骨髓细胞瘤原癌基因(cMYC),细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和细胞周期蛋白D1(cyclinD1)及转移相关蛋白钙黏蛋白E(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达。结果 GS-Rg1显著抑制TSCC细胞CAL-27的增殖能力(P<0.05),GS-Rg1作用CAL-27 48 h的IC50值为(5.46±1.58)μmol·L-1。对照组和GS-Rg1组G0/G1分别为(60.65±2.16)%和(71.20±2.38)%,细胞穿膜数分别为(87.33±7.51)和(50.67±3.21)个，荧光素酶活性分别为1.00±0.02和0.35±0.06,在统计学上差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与GS-Rg1组相比，XAV939+GS-Rg1组细胞中wnt/β-catenin信号通路活性、细胞增殖能力和转移能力均显著降低(均P<0.05),G0/G1期细胞增多(P<0.05),β-catenin、cMYC、CDK4、cyclinD1、E-cadherin、MMP-2蛋白表达均显著降低(均P<0.05),N-cadherin蛋白表达增加，而HLY78+GS-Rg1组细胞结果相反。结论 GS-Rg1下调wnt/β-catenin信号通路抑制TSCC细胞增殖和转移能力。

关键词：
Wnt/β-连环蛋白信号通路
人参皂苷Rg1
增殖
舌鳞状细胞癌
转移
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舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma, TSCC)是头颈部常见的恶性肿瘤之一，具有淋巴结转移率和复发率高的特点，导致患者预后较差[1]。人参皂苷Rg1(Ginsenosides Rg1, GS-Rg1)是人参皂苷的重要活性成分，具有多种抗肿瘤活性。研究显示GS-Rg1通过抑制有丝分裂进展抑制宫颈癌、乳腺癌、肺小细胞癌和非小细胞癌细胞的增殖能力[2]。研究报道人参皂苷的多种活性成分通过抑制wnt/β-连环蛋白(wnt/β-catenin)信号通路活性发挥抑癌作用[3],提示wnt/β-catenin信号通路的抑制可能是GS-Rg1发挥作用的机制。本研究探讨GS-Rg1通过下调wnt/β-catenin信号通路抑制TSCC细胞增殖和转移能力的作用。

一、材料与方法

1 材料

细胞TSCC细胞CAL-27,购自美国ATCC细胞库。

药品与试剂GS-Rg1,纯度：HPLC≥98%,批号：22427-39-0,购自上海源叶生物科技有限公司；Wnt/β-catenin通路抑制药XAV939,纯度：98.61%,批号：HY15174;Wnt/β-catenin通路激活药HLY78,纯度：98.49%,批号：HY-122816,均购自上海MedChemExpress试剂公司。Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified eagle medium, DMEM)细胞培养基和胎牛血清，均购自美国Gibco试剂公司；细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8),购自泰州云科生物技术有限公司；细胞周期检测试剂盒，购自上海翌圣生物科技股份有限公司；TOP/FOP Flash质粒和荧光素酶检测试剂盒，均购自上海碧云天试剂有限公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白浓度检测试剂盒，均购自福州奥研实验器材有限责任公司；细胞性骨髓细胞瘤原癌基因(cellular myelocytomatosis oncogene, MYC)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin dependent kinase 4,CDK4)、细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体，均购自英国Abcam公司。

2 实验方法

2.1 TSCC细胞培养

TSCC细胞系CAL-27快速复苏后，重悬于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，细胞培养基的pH为7.0～7.4,并放置在5%CO2、37 ℃培养箱中培养。并适时的进行细胞传代，取生长状态较好的细胞用于后续的实验研究。

2.2 CCK-8实验检测TSCC细胞增殖能力[4]4]

以每孔2 000个TSCC细胞系CAL-27接种于96孔板内，细胞贴壁后，分别用1.25、2.5、5.0和10.0 μmol·L-1的GS-Rg1处理CAL-27细胞48 h, 以0.9%NaCl作为0浓度，每个浓度有6个平行复孔。于培养箱中培养48 h后，弃掉培养基，加入DMEM培养基90 μL和的CCK-8试剂10 μL,于培养箱中孵育1 h。用酶标仪检测细胞在450 nm处的光密度(optical density, OD)值。细胞增殖抑制率=(1-GS-Rg1平均细胞OD值/0 μmol·L-1 GS-Rg1平均细胞OD值)×100%。并计算GS-Rg1作用CAL-27 48 h的IC50值，即细胞增殖抑制率为50%时对应的GS-Rg1浓度。

2.3 流式细胞术检测TSCC细胞周期分布[5]5]

以每孔1×104个TSCC细胞系CAL-27接种于6孔板内，分为对照组和GS-Rg1组，细胞贴壁后，用IC50浓度的GS-Rg1处理GS-Rg1组CAL-27细胞48 h, 对照组以0.9%NaCl处理，每个浓度3个平行复孔。于培养箱中培养48 h后，胰蛋白酶消化，并将细胞收集至流式管中。用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)洗细胞3次后，加入4 ℃预冷的无水乙醇固定细胞2 h。用PBS洗细胞2次后，分别加入RNaseA试剂100 μL和PI试剂400 μL,吹打充分混匀后于4 ℃水浴锅中孵育30 min, 于流式细胞机上检测并分析GS-Rg1对TSCC细胞周期分布的影响。

2.4 Transwell实验检测TSCC细胞转移能力[6]6]

以每孔1×105个TSCC细胞系CAL-27接种于6孔板内，分为对照组和GS-Rg1组，细胞贴壁后，分别用IC50浓度的GS-Rg1处理CAL-27细胞48 h, 对照组以0.9%NaCl处理，每个浓度3个平行复孔。于培养箱中培养48 h后，消化收集细胞，用PBS洗细胞3次后，用DMEM培养基重悬细胞，并计数，以每孔2×105个细胞、DMEM培养基100 μL接种于Transwell小室的上室中，下室中加入10%胎牛血清的DMEM培养基500 μL,每组有3个平行复孔，放置细胞培养箱中。12 h后取出Transwell小室的上室，用PBS清洗3次，经甲醇固定细胞10 min、结晶紫染色细胞20 min、PBS洗3次，并干燥后，在显微镜下观察穿膜细胞的数目。

2.5 TOP/FOP Flash荧光素酶实验检测TSCC细胞wnt/β-catenin信号通路活性[7]7]

对照组和GS-Rg1组CAL-27细胞以每孔1×104个接种于24孔板内，每个浓度6个平行复孔。放置细胞培养箱中，细胞贴壁后，将TOP/FOP Flash转染至各组细胞中，转染24 h后更换培养基，继续培养24 h后，加入裂解液，完全裂解后，收集上清液，放置于96孔板中，用酶标仪检测各组细胞荧光素酶活性。

2.6 Wnt/β-catenin通路抑制药XAV939和Wnt/β-catenin通路激活药HLY78处理TSCC细胞[8,9]8-9]

TSCC细胞系CAL-27以每孔1×105个接种于6孔板内，随机分为GS-Rg1组、XAV939+GS-Rg1组和HLY78+GS-Rg1组，用IC50浓度的GS-Rg1处理GS-Rg1组细胞，10 μmol·L-1 XAV939和IC50浓度的GS-Rg1处理XAV939+GS-Rg1组细胞，20 μmol·L-1 HLY78和IC50浓度的GS-Rg1处理HLY78+GS-Rg1组细胞，处理48 h后，按照上述实验方法，检测各组细胞中wnt/β-catenin信号通路活性、细胞增殖能力、细胞周期分布以及转移能力。

2.7 蛋白质印迹法检测细胞周期和凋亡蛋白表达[10]10]

消化收集GS-Rg1组、XAV939+GS-Rg1组和HLY78+GS-Rg1组细胞，用放射免疫沉淀裂解液裂解获得细胞总蛋白质。用二喹啉甲酸试剂盒检测蛋白浓度后，上样、电泳、湿转，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上。聚偏二氟乙烯膜与cMYC、CDK4、cyclinD1、E-cadherin、N-cadherin、MMP-2和内参GAPDH,4 ℃孵育过夜。用PBS洗3次后，与兔二抗在37 ℃下孵育2 h。用ECL增强型化学发光系统显示蛋白条带。

3 统计学处理

用SPSS 21.0 软件进行统计分析。数据用

表示，2组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验。

二、结果

1 CCK-8实验检测GS-Rg1抑制TSCC细胞增殖能力

CCK-8结果显示GS-Rg1显著抑制TSCC细胞CAL-27的增殖能力，且随着GS-Rg1浓度的增加，GS-Rg1对CAL-27细胞增殖抑制作用增强(P<0.05),GS-Rg1作用CAL-27细胞48 h的IC50=(5.46±1.58)μmol·L-1。

2 GS-Rg1抑制TSCC细胞周期进程、转移能力和wnt/β-catenin信号通路活性

流式细胞仪检测显示，对照组和GS-Rg1组G0/G1期细胞分别为(60.65±2.16)%和(71.20±2.38)%,S期细胞分别为(14.51±1.51)%和(12.60±1.23)%,G2/M期细胞分别为(24.85±0.73)%和(19.19±2.50)%。与对照组相比，GS-Rg1组CAL-27细胞周期阻滞在G0/G1期(P<0.01)。

Transwell实验结果显示对照组和GS-Rg1组细胞穿膜数分别为(87.33±7.51)和(50.67±3.21)个。与对照组相比，GS-Rg1组CAL-27细胞转移能力显著降低(P<0.01)。

TOP/FOP Flash荧光素酶检测显示对照组和GS-Rg1组细胞荧光素酶活性分别为1.00±0.02和0.35±0.06。与对照组相比，GS-Rg1组CAL-27细胞中wnt/β-catenin信号通路活性降低(P<0.01)。

3 Wnt/β-catenin通路抑制药XAV939和激活药HLY78对GS-Rg1组TSCC细胞中wnt/β-catenin信号通路活性、细胞增殖和转移能力的影响

与GS-Rg1组相比，XAV939+GS-Rg1组CAL-27细胞中wnt/β-catenin信号通路活性、细胞增殖能力和转移能力均降低，G0/G1期细胞增多(均P<0.05);HLY78+GS-Rg1组CAL-27细胞中wnt/β-catenin信号通路活性、细胞增殖能力和转移能力均增加，G0/G1期细胞降低(均P<0.05),见表1。

4 GS-Rg1对TSCC细胞 wnt/β-catenin信号通路相关蛋白和下游蛋白表达的影响

结果见表2和图1。与GS-Rg1组相比，XAV939+GS-Rg1组CAL-27细胞中 wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin蛋白表达降低，其下游增殖相关蛋白cMYC、CDK4、 cyclinD1和转移相关蛋白E-cadherin和MMP-2蛋白表达均降低(P<0.05),转移相关蛋白N-cadherin表达增加(P<0.05);HLY78+GS-Rg1组CAL-27细胞中 wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin蛋白表达增加，其下游增殖相关蛋白cMYC、CDK4、cyclinD1和转移相关蛋白E-cadherin、MMP-2蛋白表达均增加(P<0.05),转移相关蛋白N-cadherin表达降低(P<0.05)。

表1 Wnt/β-catenin通路抑制药XAV939和激活药HLY78对GS-Rg1组TSCC细胞CAL-27生物学功能的影响

表2 Wnt/β-catenin通路抑制药XAV939和激活药HLY78对GS-Rg1组TSCC细胞CAL-27生物学功能的影响

图1 以蛋白质印迹法检测GS-Rg1对TSCC细胞CAL-27中wnt/β-catenin信号通路相关蛋白和下游蛋白表达的影响

三、讨论

本研究用不同浓度的GS-Rg1处理TSCC细胞，结果表明GS-Rg1具有抗TSCC肿瘤活性。细胞周期进程的失控是引起肿瘤恶性增殖的重要机制之一，而大部分中药可以通过抑制细胞周期发挥抗癌作用[5]。本研究结果显示，GS-Rg1处理TSCC细胞后，TSCC细胞周期阻滞在G0/G1期，提示GS-Rg1通过诱导细胞周期阻滞发挥抑制TSCC增殖作用。此外研究结果显示GS-Rg1显著抑制TSCC细胞的转移能力。

既往研究报道GS-Rg1通过调控PI3K/AKT/mTOR和PD-1/PD-L1等信号通路发挥抑癌作用[11]。在阿尔茨海默病中GS-Rg1通过降低β-catenin表达，调节wnt/β-catenin信号通路改善患者的认知障碍[12]。wnt/β-catenin信号通路是经典的促癌信号途径，在包括TSCC在内的多种肿瘤中处于激活状态[12]。TOP/FOP荧光素酶实验提示在TSCC中GS-Rg1可能通过下调wnt/β-catenin信号通路发挥抑癌作用。为了进一步明确，用wnt/β-catenin信号通路抑制药XAV939和激活药HLY78分别与GS-Rg1共同处理TSCC细胞，发现XAV939促进GS-Rg1对TSCC细胞增殖和转移的抑制作用，HLY78减弱GS-Rg1对TSCC细胞增殖和转移的抑制作用，表明GS-Rg1通过下调wnt/β-catenin信号通路抑制TSCC细胞的增殖和转移能力。同时检测GS-Rg1对wnt/β-catenin信号通路相关蛋白和下游蛋白的表达，结果显示GS-Rg1显著抑制β-catenin的表达，且GS-Rg1显著抑制其下游细胞周期相关蛋白cMYC、CDK4和cyclinD1,及转移促进蛋白E-cadherin和MMP2的表达，促进转移抑制蛋白N-cadherin的表达，更进一步支持GS-Rg1下调wnt/β-catenin信号通路抑制TSCC细胞增殖和转移能力。

参考文献:

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基金资助:陕西省教育厅青年创新团队建设科研计划基金资助项目(21JP109);

文章来源:李雪,翟莎菲,马新扬,等.人参皂苷Rg1抑制舌鳞状细胞癌增殖和转移能力的作用机制研究[J].中国临床药理学杂志,2024,40(13):1888-1892.