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高效液相色谱法测定金银花中绿原酸及木犀草苷含量

2024-07-25 12 上传者：管理员

摘要：为同时测定鲜金银花中绿原酸及木犀草苷的含量，建立了一种反向高效液相色谱法，使用超声萃取进行前处理，优化了提取溶剂、提取温度、流动相等条件，并进行了方法学考察。结果表明，绿原酸和木犀草苷在0.5～100.0 mg/mL内呈现良好的线性，R2>0.999，加标回收率为96%～108%，重复性RSD分别为2.05%和2.44%。说明该方法操作简便，结果准确，可用于鲜金银花中绿原酸及木犀草苷含量的测定。

关键词：
反向高效液相色谱法
忍冬科
木犀草苷
绿原酸
金银花
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近年来，山东平邑金银花产业发展迅猛，年产干花1 800万kg，产量占全国产量的60%以上，平邑县郑城镇以7 333 hm2的种植面积、600万kg的干花产量，获得“中国金银花第一镇”的称号[1-2]。金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb）的干燥芽或早花，常用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等疾病[3-6]。金银花的功能性成分主要有酚酸类和黄酮类物质，其中酚酸类物质以绿原酸为主，黄酮类物质以木犀草苷为主。《中国药典》中对金银花中绿原酸和木犀草苷含量的规定分别为不低于1.5%和0.05%（均以干基计）[4]。绿原酸是由咖啡酸与奎宁酸组成的缩酚酸，又名咖啡单宁酸，化学名3-O-咖啡酰奎宁酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。绿原酸受热见光易分解，在水中溶解度约为4%，易溶于乙醇、丙酮、甲醇等极性溶剂，微溶于乙酸乙酯，难溶于氯仿、乙醚、苯等亲脂性有机溶剂[7]。木犀草苷又名木犀草素-7-O-葡萄糖苷、青兰苷，是一种天然黄酮类化合物，微溶于水、甲醇、乙腈，可溶于热水、热甲醇及乙醇，不溶于氯仿、乙醚、苯等亲脂性有机溶剂[8-9]。

目前测定金银花中功效成分的方法遵循《中国药典》[4]，检测方法相对独立，绿原酸及木犀草苷的提取方法、定性定量方法均不相同，但两种方法所用的提取、分析方法原理相近。吴香婷等[10]尝试采用高效液相色谱法同时测定杞菊叶黄素酯颗粒中绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A，方法简便、准确、可靠，可用于杞菊叶黄素酯颗粒的含量测定。本研究采用有机溶剂超声提取的方法，将金银花功效成分提取后，经C18反向色谱柱分离，二极管阵列检测器检测，外标法定量，旨在同时对金银花中的绿原酸和木犀草苷含量进行定性定量分析，将两种特征成分合并检测，可大幅降低金银花中功效成分测试的时间、人力、物力成本，减少浪费。

1、材料与方法

1.1 材料与试剂

金银花：采自山东平邑，用热风干燥法进行预处理。

乙醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙腈、磷酸，色谱纯，美国Thermo公司；超纯水，实验室自制；木犀草苷，纯度≥98%，上海麦克林生化科技股份有限公司；绿原酸，纯度≥98%，上海麦克林生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

U-3000高效液相色谱仪，美国Thermo公司；明澈D24 UV超纯水仪，美国Millipore公司；KQ-500E超声波提取机，昆山禾创超声仪器有限公司；涡旋振荡仪，德国IKA公司；高速离心机，美国Thermo公司；MS105十万分之一电子天平，德国Mettler公司；PL2002百分之一电子天平，德国Mettler公司；KS-1053高速粉碎机，广州市祁和电器有限公司；GZX-9240MBE热风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

取新鲜样品500 g，采用热风干燥法干燥至含水率约11%。

干燥条件：温度45℃、风速2 m/s、湿度65%，干燥4h；温度50℃、风速2 m/s、湿度50%，干燥6 h；温度55℃、风速2 m/s、湿度30%干燥至含水率11%时停止干燥[11]。将干燥后的样品放入高速粉碎机，粉碎后过65目筛[4]。

1.3.2 前处理

准确称取2.00 g样品至50 mL离心管中，加入20 mL乙醇，涡旋振荡1 min混匀后，超声20 min(60℃、2 500 W),10 000 r/min离心5 min，将上清液转移至50 mL容量瓶中，残渣再提取1次，合并上清液并定容至刻度，混匀后取10 mL至氮吹管中，40℃氮吹近干，用1 mL流动相溶解残渣，过0.22μm滤膜待上机。

1.3.3 色谱条件

固定相为Thermo公司Acclaim C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5μm）。流动相为乙腈∶0.1%磷酸水溶液=15∶85。进样量20μL，柱温40℃，检测波长340 nm。

1.4 数据处理

试验重复测定3次，数据采用Thermo Chromeleon 7处理，以绿原酸和木犀草苷为参照峰，用相对保留时间定位绿原酸和木犀草苷色谱峰，外标法定量。

2、结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取溶剂的优化

根据陈刚等[12]的研究及绿原酸、木犀草苷的性质，选用50%甲醇水溶液、50%乙醇水溶液及乙醇作为备选提取溶剂。精密称取3份试样，分别选用上述提取溶液，按照1.3.2的条件处理后上机（50%甲醇水溶液、50%乙醇水溶液提取时无需氮吹浓缩），试样中绿原酸及木犀草苷含量见表1。由表可知，用纯乙醇作为提取溶液可提取出更多的绿原酸和木犀草苷，因此选用纯乙醇作为提取溶剂。

表1 提取溶液的优化

2.1.2 提取方法的优化

根据文献资料，木犀草苷在加热条件下溶解度较高[8-9]。称取18份样品按照1.3.2的条件处理后上机，试样中绿原酸及木犀草苷含量见表2。

表2 提取方法的优化

结果表明，60℃、20 min重复提取3次效果最佳，但与60℃、20 min重复提取2次效果差异较小，综合考虑时间成本、人力成本等，最终确定采用60℃、20 min重复提取2次的提取方法。

2.2 HPLC条件的选择

2.2.1 色谱柱的选择

根据《中国药典》[4]及周湧智等[13]、张继环等[14]的研究，绿原酸及木犀草苷在C18色谱柱上有较好的保留及分离度，因此选用Thermo公司Acclaim C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5μm）。

2.2.2 流动相及洗脱程序的优化

在流动相的选择上，根据《中国药典》[4]及周湧智等[13]、张继环等[14]的研究，分别用流动相1,V（乙腈）∶V(0.1%磷酸水）=15∶85；流动相2,V（乙腈）∶V(0.5%乙酸水）=5∶95；流动相3,V（乙腈）∶V(0.1%磷酸水）=5∶95对试样上机液进行试验[15-16]。根据图谱可知，流动相1的分离度较好，色谱峰清晰，且样品流出时间较短，故选用流动相V（乙腈）∶V(0.1%磷酸水）=15∶85的比例等度洗脱对于检测金银花中绿原酸和木犀草苷较为适宜。

图1 绿原酸及木犀草苷标准品液相色谱图

2.2.3 检测波长的优化

根据文献资料，木犀草苷最大紫外吸收波长为255、350 nm，绿原酸的最大紫外吸收波长为329 nm[9-10,17-19]（木犀草苷和绿原酸实际测量光谱图如图2、3所示），故选用340 nm为金银花中绿原酸和木犀草苷的检测波长，可同时兼顾二者。

2.3 定性和定量分析

2.3.1 标准曲线

精密称取20.00 mg绿原酸标准品，将其转移至50 mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容，得到400 mg/L绿原酸标准品母液。精密称取20.00 mg木犀草苷标准品，将其转移至50 mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容，得到400 mg/L木犀草苷标准品母液。

图2 木犀草苷的紫外吸收光谱（200～400 nm)

图3 绿原酸的紫外吸收光谱（200～400 nm)

分别取绿原酸母液、木犀草苷母液0.012 5、0.025、0.25、1.25、2.5 m L至10 mL容量瓶中，用初始流动相稀释至刻度，得到梯度标准混合工作液（绿原酸和木犀草苷浓度分别为0.5、1.0、10.0、50.0、100.0 mg/L）。将配制好的梯度标准混合工作液进样测试并用外标法分析，结果见表3。结果表明，在0.5～100.0 mg/mL浓度范围内，两组分线性关系均良好，R2大于0.999，符合相关标准要求[20]。

表3 绿原酸及木犀草苷的线性关系

2.3.2 测定低限

方法测定低限一般采用3倍的20次空白值标准偏差比方法校准曲线的斜率得到[20]，如表4知，最终计算得到绿原酸和木犀草苷的测定低限分别为0.005 65 mg/L和0.007 03 mg/L，代入计算公式得到最终样品中浓度分别为0.000 141 g/100 g和0.000 176 g/100 g，远低于相关标准中对金银花中绿原酸和木犀草苷含量的要求[20]。

表4 20次空白值测量结果及测定低限

2.4 回收率和精密度

2.4.1 回收率

对金银花样品进行3水平加标回收试验，结果如表5所示，在不同加标水平下，绿原酸的平均回收率为100.44%，木犀草苷的平均回收率为102.67%，表明该方法准确高，能满足定量分析相关标准的要求[20]。

2.4.2 重复性

精密称取7个供试样品，重复测定7次，得到绿原酸和木犀草苷的平均浓度、相对标准偏差（RSD），结果见表6。由表6可知，绿原酸和木犀草苷的相对标准偏差（RSD）分别为2.05%和2.44%，结果表明该方法重复性好，能满足实验室检测的需要[20]。

表5 3水平加标回收率

表6 金银花中绿原酸及木犀草苷的含量

2.5 平邑地区金银花中功效成分含量

由表6可知，平邑地区金银花中绿原酸和木犀草苷含量分别为2.86 g/100 g和0.67 g/100 g，该数值符合《中国药典》中对金银花特征指标的要求[4]。

3、结论

研究建立了HPLC法检测金银花中绿原酸和木犀草苷的定量方法，优化了提取溶液中乙醇和水的比例、流动相的选用、流动相的比例、固定相的选用和检测波长，确定了HPLC法检测金银花中绿原酸和木犀草苷含量的最优条件。结果表明，绿原酸和木犀草苷的线性关系、检出限、精密度、重复性以及加标回收率等都满足检测需要，方法简便、快速，检测设备要求低，结果准确。该方法的建立为金银花及其加工产品质量评价技术的提升提供了依据，同时也为其他相关农产品中功能成分的快速HPLC定量分析方法的开发提供了参考。

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