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莪术醇通过PI3K/AKT信号通路介导急性髓系白血病细胞程序性死亡

2024-12-02 59 上传者：管理员

摘要：目的:探讨莪术醇对急性髓系白血病(AML)细胞恶性生物学特性的影响及其分子机制，为传统中医药抗白血病治疗提供理论与实验依据。方法:用不同浓度莪术醇作用于AML细胞株HL-60、KG-1细胞后，CCK-8法检测细胞增殖活力，Western blot检测凋亡蛋白和PI3K/AKT信号通路蛋白的表达变化，实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测Caspase家族mRNA的表达情况。结果:莪术醇可抑制HL-60、KG-1细胞的增殖活性，并诱导细胞凋亡，其通过上调Bax蛋白表达并下调Bcl-2蛋白的表达以促进细胞凋亡(P<0.05)。当莪术醇干预HL-60、KG-1细胞后，其亦可通过抑制PI3K/AKT信号通路激活而诱导AML细胞的程序性死亡。此外，莪术醇干预后可上调HL-60细胞的Caspase 3、Caspase 6、Caspase 8以及Caspase 9的表达(P<0.05),可显著上调KG-1细胞的Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9的表达(P<0.01),对Caspase 6的表达影响微弱(P<0.05),但低浓度(<60μg/ml)莪术醇对KG-1细胞Caspase 6的表达基本无影响(P>0.05)。结论:莪术醇可能通过抑制PI3K/AKT信号通路的激活、影响Bcl-2家族蛋白表达以及促进Caspase家族核心成员活化等介导AML细胞程序性死亡，从而发挥抗白血病作用。

关键词：
急性髓系白血病
抗癌机制
程序性死亡
莪术醇
骨髓造血细胞
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急性髓系白血病(AML)是一类骨髓造血细胞异常低分化的寡克隆恶性增殖性疾病，也是成年人最常见的血液系统恶性肿瘤[1]。尽管标准诱导缓解化疗、新型靶向药物、表观遗传学治疗乃至骨髓移植方案不断优化与改进，但由于AML疾病本身的高度异质性，加之其复杂的分子生物学及细胞遗传学异常特征，AML患者仍面临复发和难治性问题的困扰，长期生存率仍偏低[2]。莪术醇(Curcumol)作为纯天然中草药莪术的经典特征活性成分，已有研究证实了其有效抑制了肝癌[3]、乳腺癌[4]、结直肠癌[5]、膀胱癌[6]、鼻咽癌[7]等多种肿瘤细胞的生长。目前，莪术醇在恶性血液病中的研究极少，仅个别研究证实其在多发性骨髓瘤(MM)和慢性粒细胞白血病(CML)中具有诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞恶性增殖的作用[8-9]。为此，本研究通过莪术醇体外干预AML细胞，探讨莪术醇对AML细胞恶性生物学特性的影响及其分子机制，为白血病的临床治疗与抗白血病基础研究提供实验依据。

1、材料和方法

试剂与仪器

胎牛血清FBS、RPMI 1640培养基均购于美国Gibco公司；青-链霉素双抗、CCK-8检测试剂盒购于上海碧云天生物公司；二甲基亚砜购于美国Sigma公司；TRIzol试剂购于上海Invitrogen公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇均购于上海振兴化工公司；DEPC购于上海生工公司；逆转录试剂盒、SYBR GreenMaster(ROX)均购于南京诺唯赞公司；莪术醇购于美国Selleck公司；PI3K、p-PI3K(Ser249)、AKT、p-AKT(Ser473)、Bcl-2、Bax以及GAPDH抗体均购于美国CST公司；超净台、酶标仪、CO2细胞培养箱购于美国Thermo公司；恒温水浴锅购于常州朗越仪器制造公司；离心机、移液枪及微量加样器均购于德国Eppendorf公司；超低温-80℃冰箱购于美国Thermo公司；荧光定量PCR仪购于美国Roche公司；引物序列由广州锐博生物科技公司设计与合成。FACS流式细胞仪购于BD公司。

细胞株与细胞培养

人AML细胞株HL-60、KG-1细胞由本院科研中心保藏提供。将AML细胞置于含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素双抗的RPMI 1640培养基中，并在37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。细胞每2-3 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

CCK-8检测细胞增殖活性

取对数生长期HL-60、KG-1细胞，制备成单细胞悬液并调整细胞密度至4×104/ml接种于96孔板，每孔100μl体系，其中细胞悬液90μl及10μl莪术醇，使莪术醇终浓度分别为0、30、60、90、120、240μg/ml。各实验组设3个复孔，同时设置空白对照组，分别在37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养24、48及72 h,按CCK-8试剂盒说明书要求，每孔加入10μl的CCK-8溶液并置于培养箱中孵育2 h,用酶标仪检测波长450 nm吸光度值(A450),实验重复3次，取均值。按下列公式计算细胞增殖活性：

细胞活力(%)=[(A加药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)]×100%

Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡

取对数生长期HL-60、KG-1细胞，调整细胞浓度至1×105/孔，接种于6孔板，予0、30、60、90μg/ml莪术醇干预，在37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养48 h后，收集细胞并离心，PBS洗涤细胞2次，弃上清，向管中加入400μl×Annexin V重悬细胞，再加入5μl的Annexin V-FITC染色液，4℃避光孵育20 min,后加入10μl PI染液，4℃避光孵育5 min,后用BD FACSVerse流式细胞仪检测细胞凋亡率，采用FlowJo 10.0软件分析结果。

Western blot检测凋亡蛋白及信号通路蛋白的表达

取对数生长期HL-60、KG-1细胞，予0、60、90、120μg/ml莪术醇干预，在37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养48 h后，收集细胞并离心，PBS清洗细胞2次，弃上清，使用全细胞蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，并利用BSA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。使用等量蛋白质予SDS-PAGE电泳，后将其转移至PVDF膜上，脱脂牛奶室温封闭1 h,一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤后二抗孵育1 h,使用ECL化学发光试剂盒处理PVDF膜，在成像系统下曝光成像。

RT-qPCR技术检测Caspase家族mRNA的表达

取对数生长期HL-60、KG-1细胞，予0、60、90、120μg/ml莪术醇干预，在37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养48 h后收集细胞并离心，PBS清洗细胞2次，弃上清，采用TRIzol RNA提取试剂盒提取总RNA,检测浓度和纯度后按逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA,应用实时荧光定量PCR仪和SYBR GreenMaster(ROX)试剂盒进行PCR扩增，以GAPDH为内参照，引物序列参照表1。总反应体系20μl,包括：2μl cDNA,10μl SYBR Green(ROX),上、下游引物各0.5μl, RNase-free ddH2O 7μl;反应条件为：第一阶段(预变性): 50℃2 min、95℃10 min, 1个循环；第二阶段：95℃15 s(变性)、60℃1min(退火/延伸),共40个循环；第三阶段(溶解曲线分析): 95℃15 s、60℃1 min、95℃30 s、60℃15 s, 1个循环；采用Ct值比较法进行qRT-PCR结果分析，并对比Caspase家族成员mRNA表达水平，即ΔCt=Ct值目的基因-Ct值GAPDH,采用2-ΔΔCT法计算各目的基因相对表达量，其中ΔΔCT=(CT目的基因-CTGADPH)实验组-(CT目的基因-CTGADPH)对照组。

统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。用GraphPad Prism7软件制图。本研究所有计量资料均以表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

莪术醇对AML细胞增殖的影响

如图1所示，予不同浓度梯度(30、60、90、120、240μg/ml)的莪术醇干预HL-60、KG-1细胞24、48及72 h后，CCK-8检测结果显示，与对照组比较，细胞增殖活性均降低，呈现时间(rHL-60=-0.837,rKG-1=-0.916)与浓度(rHL-60=-0.795,rKG-1=-0.843)依赖性的方式抑制细胞增殖。

莪术醇对AML细胞凋亡的影响

如图2所示，予30、60、90μg/ml莪术醇干预HL-60、KG-1细胞48 h后，各药物组细胞的凋亡率均高于对照组，并呈浓度依赖性(rHL-60=0.794,rKG-1=0.823)。

莪术醇对AML细胞凋亡蛋白表达的影响

如图3所示，莪术醇干预HL-60、KG-1细胞48 h后，与对照组相比，各莪术醇浓度组促凋亡蛋白Bax表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调(P<0.05),提示莪术醇可诱导细胞凋亡。

莪术醇对AML细胞PI3K/AKT信号通路的影响

如图4所示，莪术醇干预HL-60、KG-1细胞48 h后，与对照组相比，各莪术醇浓度组p-PI3K、p-AKT水平下降，提示其可通过下调PI3K、AKT磷酸化水平继而诱发AML细胞程序性死亡。

莪术醇对AML细胞Caspase家族基因表达的影响

如图5所示，用不同浓度莪术醇干预HL-60、KG-1细胞48 h后，与对照组比较，各莪术醇浓度组HL-60细胞中Caspase 3、Caspase 6、Caspase 8以及Caspase 9的表达上调(P<0.05),KG-1细胞中Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9的表达显著上调(P<0.01),对Caspase 6的表达影响微弱(P<0.05),但低浓度(<60μg/ml)莪术醇对KG-1细胞的Caspase 6的表达较对照组无统计学差异(P>0.05)。

3、讨论

相较于其他血液系统恶性肿瘤，AML的诱导治疗常以基于阿糖胞苷联合蒽环类药物组合的“7+3”方案为主，但由于大多数亚型AML致病机制尚未完全阐明，复发、难治常见，致使AML患者的疗效欠佳、预后差[10-11]。近年来，随着祖国传统中医药临床与基础研究的不断挖掘，学术界已证实，许多纯天然中草药的有效成分在抗白血病的治疗和研究中扮演了重要的角色[12-14],为白血病的治疗提供了新的策略。

莪术为温性中药，味辛而苦，有疏气破血、消积、止痛等功效。现代植物化学研究表明，莪术中的主要化学成分为挥发油、多糖、姜黄醇、甾醇、酚酸和生物碱等，其中莪术醇是莪术药材中含量最高的有机成分[15-16]。研究证实，莪术醇具有潜在的抗炎、镇痛、抗氧化应激以及抗肿瘤等生物学活性，并参与调节血管生成、促进伤口愈合等过程[17-19]。在肿瘤学领域，Li等[20]研究发现，莪术醇可有效抑制肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，证实莪术醇通过PI3K/Akt和Wnt/β-catenin通路的失活来介导肺腺癌的恶性生物学行为。Guan等[21]研究表明，莪术醇通过下调EB病毒抗原1(EBNA1)并靶向核糖素(NCL)抑制VEGFA/VEGFR1/PI3K/AKT信号通路发挥抗EBV阳性鼻咽癌侵袭和转移的作用。Huang等[22]研究证实，莪术醇可通过抑制PI3K/AKT通路提高胃癌细胞对顺铂化疗的敏感性。此外，Ning等[23]研究表明，莪术醇可通过抑制ERK/NF-κB信号转导并促进miR-152-3p表达，同时使c-MET/PI3K/AKT信号通路表达受抑，从而抑制黑色素瘤的增殖、进展和转移。综上，莪术醇是许多肿瘤细胞凋亡的有效诱导剂，并通过靶向MAPK/ERK、PI3K/AKT等关键信号通路，从而显现其在癌症治疗中的多靶点活性[24]。

本研究通过体外予不同浓度梯度莪术醇干预HL-60、KG-1细胞后，AML细胞增殖活性受到抑制，并呈现时间与浓度依赖性，表明，莪术醇可抑制HL-60、KG-1细胞的增殖活性，且本研究还通过流式细胞术检测细胞的凋亡，证实了莪术醇可诱导AML细胞发生凋亡。进一步研究结果显示，莪术醇可上调AML细胞中促凋亡蛋白Bax的表达并下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，继而诱发白血病细胞凋亡效应。同时，本研究还发现，当莪术醇干预HL-60、KG-1细胞后，其可通过抑制PI3K/AKT信号通路激活来介导AML细胞程序性死亡。上述结果表明，莪术醇在AML细胞株中具有诱导凋亡的作用，其机制可能与影响Bcl-2家族蛋白表达并抑制PI3K/AKT信号通路的激活等有关。

Caspase家族作为一类半胱氨酸蛋白酶，其亦被称为CD蛋白水解酶家族，与秀丽隐杆线虫细胞中的线虫自杀基因所编码的死亡蛋白酶(cell death abnormal-3,CED-3)存在高度同源性[25]。Caspase家族各成员通常以无活性的酶原状态存在，在特殊生化状况下，其可通过催化C端半胱氨酸残基，进而特异性裂解天冬氨酸残基后的肽键执行相应生物学功能。目前，学术界在哺乳动物中至少发现16种Caspase,其大致可分为凋亡起始子Caspase 2、Caspase 8、Caspase 9和Caspase 10,凋亡执行子Caspase 3、Caspase 6和Caspase 7以及具备炎性因子活性的Caspase 1、Caspase 4、Caspase 5和Caspase 11[26]。一般而言，Caspase活化状态可切割不同底物，继以实现各式的细胞死亡表型，进而实现抗肿瘤效应[27]。为此，本研究用不同浓度梯度莪术醇体外干预HL-60、KG-1细胞，分析莪术醇对白血病细胞中Caspase家族成员mRNA表达的影响，结果发现莪术醇干预后可上调HL-60细胞Caspase 3、Caspase 6、Caspase 8以及Caspase 9的表达，而干预KG-1细胞后可上调Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9的表达，但低浓度莪术醇对Caspase 6的表达无影响。上述结果表明，莪术醇可通过影响Caspase家族成员的活化水平，继而产生白血病细胞的凋亡效应，但其间详细的分子机制有待本课题组后续的深入实验研究予以探索和阐明。

总之，本研究的独特之处在于探讨了传统中草药有效成分莪术醇抗白血病的潜在作用，通过体外实验分析发现莪术醇可显著抑制AML细胞的增殖活性，并诱导细胞凋亡，进一步的研究揭示莪术醇可能通过抑制PI3K/AKT信号通路、影响Bcl-2家族蛋白表达以及促进Caspase家族核心成员活化等介导AML细胞程序性死亡，从而发挥抗白血病作用。这些发现为传统中医药在白血病治疗领域的应用提供有力的实验依据，值得后续进一步深入研究。

参考文献:

3吴皓,李政,彭信幸.莪术醇通过调控PI3K/AKT通路促进人肝癌HepG2细胞凋亡.中南药学,2019,17(01):11-14.

8孙红,李凌云,周湘明,等.莪术醇对体外多发性骨髓瘤细胞生物学行为的影响.中国中西医结合杂志,2016,36(10):1229-1234.

12梁艳,杨爱莹,刘敏,等.香芹酚对白血病细胞生物学行为的影响及其机制.中国实验血液学杂志,2022,30(2):393-399.

13李莹莹,刘红春,张倾,等.姜黄素对人急性髓系白血病细胞株K562增殖､凋亡及细胞周期的影响.中国实验血液学杂志,2022,30(5):1343-1347.

14潘巍,沈燕,骆波,等.双氢青蒿素通过激活氧化应激诱导急性髓系白血病细胞自噬性死亡.中国实验血液学杂志,2022,30(4):1011-1017.

基金资助:国家自然科学基金(62161001);江西省中医药管理局科技计划项目(2022B072);

文章来源:李祚涛,陈小芸,李海亮,等.莪术醇通过PI3K/AKT信号通路介导急性髓系白血病细胞程序性死亡[J].中国实验血液学杂志,2024,32(06):1682-1688.