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初诊急性髓系白血病患者体内MAIT细胞的表达和功能

2024-12-02 34 上传者：管理员

摘要：目的：探讨初诊急性髓系白血病（AML）患者外周血黏膜相关恒定T（MAIT）细胞数量与免疫功能的变化，及其与AML发生、发展的关系。方法：选择2022年1月-2023年2月本院75例初诊AML患者临床样本以及48例健康对照样本作为研究对象，采用多参数流式细胞术检测样本中的MAIT细胞数量、膜表面标志物、效应表型以及功能指标。结果：与健康对照相比，初诊AML患者外周血MAIT细胞占CD3+T细胞比例显著降低（P<0.001）。患者骨髓中的MAIT细胞占全部CD3+T细胞比例与外周血类似（P>0.05）。AML患者外周血MAIT细胞多为效应记忆型T细胞，且与健康对照相比，效应记忆型MAIT细胞比例降低（P<0.05），而终末分化效应记忆型MAIT细胞与PD-1+MAIT细胞比例明显增高（均P<0.05）。AML患者外周血MAIT细胞表达颗粒酶B、穿孔素的水平明显高于健康对照（均P<0.05），分泌γ干扰素、肿瘤坏死因子α等细胞因子的水平明显低于健康对照（均P<0.001）。结论：AML患者体内MAIT细胞比例降低且功能标记物表达异常，提示其功能受损，可能参与AML的发生、发展。

关键词：
免疫细胞
急性髓系白血病
程序性死亡受体1
细胞因子
黏膜相关恒定T细胞
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急性髓系白血病（AML）是一种髓系前体细胞分化、增殖、细胞周期进程受到影响的恶性疾病，表现为骨髓正常造血能力衰竭，易出现感染、出血、贫血等症状。化疗、干细胞移植等方式仍是治疗该病的传统手段，但这些方法增加了患者对病原体的易感性，以及合并症与免疫抑制的出现概率。在肿瘤免疫治疗的背景下，利用免疫系统对抗AML展现出重要的作用，而充分了解AML患者免疫系统的组成是研究起始的关键[1-3]。

先天性免疫在抗肿瘤的免疫应答中起着至关重要的作用，其中黏膜相关恒定T(mucosal-associated invariant T,MAIT）细胞是人类先天性免疫细胞的重要一员，在先天性免疫与适应性免疫之间起桥梁作用。MAIT细胞识别微生物核黄素合成途径中产生的代谢产物5-(2-氧丙基亚氨基)-6-d-三丁基氨基尿嘧啶，由Ⅰb型主要组织相容性复合物相关分子呈递通过TCR途径激活[4]，也可以直接被白介素12、18以非依赖TCR的途径激活[5]。激活后的MAIT细胞具有强烈的细胞毒性，并产生一系列相关的细胞因子，在多种感染性疾病、自身免疫性疾病以及恶性肿瘤中扮演着不同的角色[6-8]。为深入了解AML患者体内MAIT细胞的数量与功能变化，笔者应用多参数流式细胞术对MAIT细胞进行分析研究，现报道如下。

1、资料与方法

病例资料

纳入安徽医科大学第二附属医院自2022年1月至2023年2月收治的75例初诊AML患者作为研究组，有完整的临床资料和实验室资料（入院后抽取外周血与骨髓血进行流式细胞术白血病免疫表型分析），所有患者均未合并获得性免疫缺陷综合征、重要脏器疾病以及其他恶性肿瘤。选择同期本院体检中心48例健康人作为对照组，性别与年龄构成与研究组均无显著性差异。本研究经安徽医科大学第二附属医院伦理委员会批准，入组成员全部签署书面知情同意书。

MAIT细胞的检测

健康组空腹采集静脉EDTA抗凝血10 ml，新诊断AML患者外周血或骨髓血抽取后使用肝素管抗凝。室温25℃，6 h内处理，取200μl加入流式管中，裂解红细胞后加入细胞染色Buffer调整细胞浓度为1×107/ml，加入Fc受体封闭剂排除Fc受体与抗体结合的非特异性信号，再加入CD3、CD45、Vα7.2、CD161等单克隆抗体各5μl混匀，4℃避光孵育30min。使用Cyto FLEX流式细胞仪（Beckman Coulter公司，美国）采集105细胞/管，Cyt Expert软件分析处理，分析AML患者外周血或骨髓血中MAIT细胞占CD3+T淋巴细胞的比例。本研究中MAIT细胞的免疫表型为CD3+CD161++Vα7.2+CD45+。

MAIT细胞膜表面蛋白与细胞毒性标志物检测

方法步骤同上，在加入原有抗体的同时，再加入荧光通道各不相同的CD4、CD8、CD45RA、CCR7、程序性死亡受体1(PD-1）等单克隆抗体，检测样本中CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞，以及初始T细胞（CD3+CCR7+CD45RA+CD45+）、中央记忆T细胞（CD3+CCR7+CD45RA-CD45+）、效应记忆T细胞（CD3+CCR7-CD45RA-CD45+）、终末分化效应记忆T细胞（CD3+CCR7-CD45RA+CD45+）等淋巴细胞的表达。在细胞膜表面抗体染色完成后，加入Fixation Buffer室温避光固定细胞20 min，加入缓冲液后离心弃上清，加入稀释后的Permeabilization Wash Buffer破膜打孔，最后加入相应的颗粒酶B、穿孔素单克隆抗体室温避光孵育20 min后上机检测。

全血样本活化和细胞内蛋白因子染色

取肝素抗凝全血150μl和无菌培养基1:1混合于试管中，加入Cell Activation Cocktail(with Brefeldin A）在37℃、5%CO2的培养箱中培养4-6 h。细胞经刺激且阻断胞内蛋白转运后取出，细胞表面染色与固定、破膜打孔步骤同前，各管加入相应的γ干扰素（INF-γ）与肿瘤坏死因子α(TNF-α）单克隆抗体室温避光20 min，上机检测，并进行数据分析。

统计学分析

应用Graph Pad Prism 8和IBM SPSS Statistics 26软件进行作图与统计学分析，样本检测结果以均数±标准差（±SD）表示。组间连续变量使用t检验或Mann-Whitney U检验比较，多个样本之间比较使用单因素方差分析，采用Pearson或Spearman进行相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

AML患者体内MAIT细胞比例

通过流式细胞术（FCM）找出免疫表型为CD3+Vα7.2+CD161++CD45+的细胞亚群为MAIT细胞，具体圈门策略见图1A。分析AML患者外周血MAIT细胞所占全部CD3+T细胞的（2.29±2.09）%，明显低于健康人群的（5.12±3.23)%(P<0.001）（图1B）。通过膜表面分子CD4与CD8可将MAIT细胞分成CD4+、CD8+和CD4-CD8-等3种常见亚群。本研究结果显示，AML患者体内主要表现为CD8+MAIT亚群比例降低（P<0.05）(图1C)，而CD4+MAIT与CD4-CD8-MAIT亚群较健康人群无明显差异（P>0.05），但3种亚群的绝对值较健康人群均显著降低，提示AML患者外周血中MAIT细胞数量耗竭。抽取AML患者骨髓样本加入相应抗体进行FCM分析，与对应的外周血进行配对比较。结果显示，患者骨髓中的MAIT细胞占全部CD3+T细胞比例与外周血类似，比较差异无统计学意义（P>0.05）（图1D）。

MAIT细胞与患者临床特征的关系

将AML患者按照不同临床特征分组，分析各组患者外周血中MAIT细胞占CD3+T细胞的比例。将患者按照危险度分层分为低危、中危、高危3组，采用单因素方差分析结果显示，低危组患者体内MAIT细胞占CD3+T细胞的比例显著高于高危组（P<0.01），而中危组与低、高危组患者比较差异均无统计学意义（P>0.05）（图2A）。在已检测的59例患者中，34例为常见基因发生突变的患者，如异柠檬酸脱氢酶（IDH）、核磷蛋白1(NPM1）、Fms样酪氨酸激酶3(FLT3）等，突变型患者较其余25例野生型患者体内MAIT细胞占CD3+T细胞的比例更低，差异有统计学意义（P<0.01）（图2B）。34例初诊时伴随着肺部或其他部位感染的患者较30例初诊时未伴有病原体感染的患者体内MAIT细胞占CD3+T细胞的比例降低，差异有统计学意义（P<0.05）（图2C）。将患者按年龄、性别、FAB亚型以及实验室指标乳酸脱氢酶、β2-微球蛋白正常值进行分组，分析组间MAIT细胞占CD3+T细胞的比例差异，结果显示均无统计学意义（P>0.05）（表1）。应用Pearson或Spearman分析，发现初诊AML患者外周血MAIT细胞占CD3+T细胞的比例与患者年龄（图2D）、白细胞计数、外周血淋巴细胞百分比、淋巴细胞绝对值、血红蛋白、血小板计数、乳酸脱氢酶、β2-微球蛋白、外周血原始细胞比例、骨髓原始细胞比例均无相关性（均P>0.05）。

MAIT细胞的效应表型与免疫检查点

T细胞根据细胞膜表面分子CD45RA、CCR7分为4个主要亚群。本研究结果显示，AML患者外周血中的MAIT细胞主要为效应记忆型T细胞（图3A），与健康人群相比，AML患者效应记忆型MAIT细胞占全部MAIT细胞的百分比明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）（图3B),AML患者外周血中终末分化效应记忆型MAIT细胞的比例显著高于健康人群（P<0.05）（图3C）。通过FCM检测患者体内免疫细胞表面免疫抑制分子的表达，结果显示，AML患者外周血中PD-1+MAIT细胞比例显著高于健康人群，比较差异有统计学意义（P<0.01）（图3D）。

AML患者体内MAIT细胞功能变化

比较初诊AML患者与健康人群外周血MAIT细胞表达颗粒酶B、穿孔素的水平，结果显示，AML患者外周血中CD3+MAIT与CD3+CD8+MAIT细胞表达颗粒酶B、穿孔素水平较健康人群均显著上调，差异有统计学意义（均P<0.05）（图4A-B）。由于AML患者体内CD4+MAIT与CD4-CD8-MAIT细胞亚群数量较少，因此未纳入统计分析。全血样本经活化与胞内蛋白因子染色，通过FCM检测MAIT细胞INF-γ、TNF-α的表达水平，结果显示，AML患者体内MAIT细胞INF-γ、TNF-α的表达水平较健康人群显著下调，差异有统计学意义（均P<0.05）（图4C-D）。

3、讨论

近年来，非典型T细胞（γδT、NKT、MAIT）成为各种肿瘤疾病相关细胞免疫治疗中的研究焦点，不同于传统的免疫细胞，它们可对特定的抗原做出快速的反应[9-10]。研究发现，MAIT细胞在多种感染性疾病、自身免疫性疾病与实体肿瘤中存在数量耗竭，并会迁移到炎症部位或肿瘤中心，分泌各种细胞因子，参与疾病的发生、发展[6-8]。

在血液系统恶性肿瘤中，关于MAIT细胞的报道较少，研究发现，在多发性骨髓瘤患者体内MAIT细胞的数量减少，发生类似于Ⅰ型辅助性T细胞（Th1）功能障碍，即分泌INF-γ、TNF-α的能力减弱。相比健康人群，PD-1+MAIT细胞占比上升，提示存在免疫功能缺陷，体外PD-1阻断实验可使患者MAIT细胞重新被活化，功能表型可得以恢复。有研究也证明了MAIT可在体外大量扩增，具有杀伤骨髓瘤细胞系的能力[11]。

本研究结果显示，在初诊AML患者体内，MAIT细胞占CD3+T细胞的比例较健康人群显著降低，主要降低的亚群集中在CD8+MAIT细胞，这可能是因为人体内频率最高、发挥最主要功能的MAIT细胞亚群就是CD8+MAIT。MAIT细胞的初始发育在骨髓，骨髓中MAIT细胞与外周血MAIT细胞有着共同的抗原受体分子，很大程度上反映了外周血[4]。通过配对分析，本研究并未发现患者外周血MAIT细胞数量的减少是因为其迁移到骨髓微环境，这与MAIT细胞在多发性骨髓瘤中的研究类似[11]。研究发现，健康人体内MAIT细胞数量随年龄增长而减少[12]，然而，与健康人群不同，AML患者体内MAIT细胞数量并未随着年龄的增长有着显著的下降趋势，这可能与所检测样本量不足或疾病本身的特点有关。最近的一项研究发现，初诊时AML患者体内MAIT细胞的数量、比例可能与不良的细胞遗传学特征有关[13]。本研究对患者临床资料的分析结果显示，不良预后基因阳性患者外周血MAIT细胞占CD3+T细胞的比例较野生型更低，危险度分层分析结果显示，高危AML患者体内MAIT细胞比例较低危更低，表明患者体内MAIT细胞耗竭可能受到基因突变的影响甚至导致不良的预后。T细胞根据细胞膜表面分子CD45RA、CCR7分为4个主要亚群[14]，分别是初始细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞和重新表达CD45RA的终末分化效应记忆细胞。初诊AML患者体内MAIT细胞大部分是效应记忆细胞，有着向终末分化阶段演变的趋势，提示其可能发生衰老，可塑性降低，对新抗原刺激的敏感性降低等，这与Duan等[15]在关于MAIT细胞在肝细胞癌中的研究结果类似。在登革热与流感病毒等急性病毒感染患者中，MAIT细胞迅速获得活化表型，其特征是活化和衰竭的标记物表达上升，如CD38、CD69、PD-1和TIM3[16-17]。免疫检查点的上调参与维持免疫抑制微环境。PD-1分子是免疫细胞上最主要的免疫抑制分子，PD-1在CD8+T细胞上的过表达是T细胞耗竭的指标之一，它与PD-L1和PD-L2两种配体的信号通路可抑制免疫细胞的效应功能。PD-L1在多种肿瘤细胞上高表达形成免疫抑制性的肿瘤微环境，使肿瘤细胞发生免疫逃逸。在有关MAIT细胞与多数实体肿瘤的研究中，MAIT细胞表面PD-1分子显著上调[14-15]。本研究结果显示，在AML患者体内，PD-1+MAIT细胞比例增加，提示MAIT细胞正常免疫功能受损，这可能与效应记忆型MAIT细胞向终末分化型转变，最终逐步走向免疫功能耗竭等方面存在紧密联系。HLA-DA表达增加提示T细胞处于活化状态，Comont等[13]发现AML患者体内活化的HLA-DR+MAIT细胞比例显著增加，猜测MAIT细胞数量、比例降低可能与活化后的MAIT细胞发生凋亡有关。本研究进一步分析了AML患者与健康人群体内MAIT细胞在功能上的差异性。静息状态的MAIT细胞能够释放颗粒酶B、穿孔素等细胞毒性颗粒，活化后的MAIT细胞具有类似Th1型细胞的功能，主要分泌INF-γ、TNF-α等细胞因子，分别发挥抗感染与抗肿瘤的作用。FCM分析发现AML患者体内MAIT细胞表达颗粒酶B、穿孔素的水平增强，分泌Th1型细胞因子的能力减弱，提示可能是因为受到白血病细胞的影响，MAIT细胞处于活化且即将耗竭的状态，仍能够表达大量的细胞毒性颗粒，然而经PMA（佛波酯）和Ionomycin（离子霉素）刺激活化后表现出的抗肿瘤能力却大不如前，这一点与在多发性骨髓瘤中的研究结果类似[11]，当然这也需要进一步的研究证实。

综上所述，本研究结果显示，AML患者循环MAIT细胞百分比显著低于健康人，MAIT细胞表面耗竭分子PD-1表达上调，主要为效应记忆型细胞，有着向终末分化型演变的趋势，提示可能发生衰老，可塑性降低，对抗原刺激的敏感性降低。此外，患者MAIT细胞的抗肿瘤功能受损，提示在患者治疗过程中需关注MAIT细胞在频率和功能上的恢复，以发挥MAIT细胞独特的先天性免疫功能。

参考文献:

3陈泽慧,李越洋,田晨.急性髓系白血病免疫治疗药物的研究进展.中国实验血液学杂志,2020,28(6):2089-2092.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(82200225);

文章来源:彭谦,王芝涛,黄仁华,等.初诊急性髓系白血病患者体内MAIT细胞的表达和功能[J].中国实验血液学杂志,2024,32(06):1644-1650.