急性髓系白血病(AML)是一种高度异质性的，来源于造血干、祖细胞的恶性克隆性疾病。尽管治疗手段不断进步，但在接受化疗的AML患者中，确诊后存活>5年的病例不到40%[1]。AML的预后评估为更好选择临床治疗策略以延长患者生存时间提供重要参考。目前，AML的预后评估体系主要依据细胞遗传学和分子遗传学指标进行预后分层。但预后分层不能很好预测所有AML患者，因此，需要更多的生物标志物进行精准预测。随着基因组测序技术的不断完善和改进，一些表观遗传学相关的基因被发现与AML诊断、危险度分层、疾病进展密切相关[2,3]。表观遗传学是指在不改变DNA序列情况下引起基因表达水平上的可遗传性改变，其异常调控可能导致自身免疫性疾病、癌症和各种其他疾病[4]。RNA甲基化是一种类似于DNA甲基化、组蛋白修饰的转录后水平的表观遗传学改变，最常见的类型是N6-甲基腺嘌呤(m6A)甲基化，由甲基化转移酶、去甲基转移酶和阅读相关蛋白共同参与调节。研究表明，m6A RNA甲基化与正常和恶性造血及其相关过程密切相关，对白血病细胞的增殖、凋亡、分化、耐药及祖细胞(LSC/LIC)的自我更新均有影响[5,6,7,8]。

胰岛素样生长因子II mRNA结合蛋白(IGF2BPs)作为一种m6A RNA甲基化阅读相关蛋白具有保守的单链RNA,由6个典型的RNA结合域组成，包括2个RNA识别基序(RRM)和4个KH结构域(KH)。IGF2BPs由IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3组成，在维持mRNA的稳定和翻译的过程中发挥重要作用[9]。研究表明，IGF2BPs在各类人类癌症中常扩增或高表达，与各种恶性肿瘤总体不良预后和转移有关[10]。文献报道，IGF2BP2高表达的AML患者的总体存活率低于低表达的患者[11],但IGF2BP3 在AML中是否发挥重要的功能尚未有报道，值得进一步研究。

因此，本研究欲通过AML患者的骨髓原代白血病细胞转录组高通量测序结果，分析IGF2BP3在难治AML患者及化疗敏感AML患者中表达量的差异，采用RT-qPCR、Western blot检测AML病人样本、细胞系及其对应蒽环类耐药细胞系中IGF2BP3的表达水平，通过对746例AML患者进行多维度数据分析，初步探讨IGF2BP3与AML不良预后的关系，为AML患者新的临床预后与治疗策略提供依据。

一、材料和方法

病例

本研究的患者信息来源于1个临床队列及4个独立的公共数据库。

队列1 来自于解放军总医院第一医学中心血液科2021年1月至2021年12月的27例AML患者(不含急性早幼粒细胞白血病),包含初次就诊的转录组数据和详细临床信息。诊断标准参照《中国成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病)诊疗指南(2021年版)》,中位年龄49(23-74)岁，男性患者14例，女性患者13例，2个疗程化疗方案未能获得完全缓解的AML患者为难治性AML患者(Refractory AML)。

队列2 来自于人类癌症基因组图谱数据库(TCGA),该数据库收集了200例有临床信息注释的成年初治AML患者样本，包含完整的基因组、转录组测序数据集详细临床信息。本研究选取其中163例接受转录组测序的患者(不含急性早幼粒细胞白血病)作为研究队列，化疗方案均采用标准剂量7+3方案：阿糖胞苷7 d联合去甲氧柔红霉素或柔红霉素3 d, 诱导缓解后行巩固治疗或造血干细胞移植，巩固治疗包含4至6个疗程化疗。

队列3-5 分别来源于美国国立生物技术信息中心的基因表达数据库(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo): GSE9476数据集，包含了20名健康供体的正常造血细胞和来自26名 AML 患者的白血病原始细胞之间的基因芯片表达数据；GSE6891数据集，包含420例急性髓系白血病患者的相关基因芯片分析及临床数据信息，该研究由威尔康奈尔医学院和伊拉斯姆斯大学医学中心的审查委员会批准，所有患者治疗方案均按照荷兰-比利时血液学肿瘤合作试验组(HOVON)的研究方案进行统一治疗；GSE12417数据集，包含163 例未经治疗的急性髓性白血病成年患者的骨髓或外周血单个核细胞样本基因芯片表达数据和总生存期 (OS)的临床数据信息。

试剂与仪器

胎牛血清、青霉素链霉素双抗混合液及RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司；RNA快速提取试剂盒、快速逆转录试剂盒均购自上海奕杉生物科技公司，KAPA SYBR FAST q-PCR Master Mix (2x)试剂盒购自美国KAPA公司；引物合成由北京博迈德基因技术公司合成；BCA 蛋白定量试剂盒购自上海碧云天(艾瑞生物)公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、Protein Marker购自北京索莱宝公司；PVDF膜及ECL发光剂购自美国Millipore公司；IGF2BP3、GAPDH抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；Echinomycin Streptomyces sp.购自德国Merck公司；细胞培养箱、全自动酶标仪均为美国Thermofisher公司产品，实时荧光定量PCR仪器为美国Applied Biosys tems公司产品，ChemiDocTM成像系统为美国BIO-RAD公司产品。

标本采集

所有患者标本均抽取骨髓血或静脉血5 ml置于EDTA 抗凝管，采用Ficoll分离液(中国天津灏洋生物制品科技有限责任公司)提取单个核细胞，通过密度梯度进行离心分离后保存于-80 ℃备用。

细胞培养

HL60细胞株及其蒽环类耐药细胞株HL60/ADR,K562细胞株及其蒽环类(阿霉素)耐药细胞株K562/ADR均来自于解放军总医院第一医学中心血液病科实验室，由解放军总医院血液科实验室冻存。冻融后悬于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(含100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素，pH值调至7.2-7.4)中，置于37 ℃、5% CO2 培养箱中常规孵育，2-3 d换液，分瓶传代继续培养。取对数生长期的细胞用于后续实验。

总RNA提取及RT-qPCR检测mRNA表达水平

收集适量HL60、HL60/ADR、K562、K562/ADR细胞及化疗敏感AML患者样本、难治AML患者样本，用RNA快速提取试剂盒提取细胞总RNA。用紫外分光光度计以OD260/280的比值进行RNA样品的纯度判定与浓度测定。RNA纯度和浓度合格者将RNA利用快速逆转录试剂盒制备cDNA。用KAPA SYBR FAST q-PCR Master Mix (2x)试剂盒完成qPCR检测。以GAPDH作为对照。反应体系为20 μl, 扩增条件： 95 ℃预变性20 s; 然后95 ℃变性3 s, 60 ℃退火20 s, 72 ℃延申20 s, 共进行40个循环。所用引物序列如下： IGF2BP3: 上游引物5′-GAGGCGC-TTTCAGGTAAAATAG-3′,下游引物 5′-AATGAGG-CGGGATATTTCGTAT-3′。

Western blot 检测蛋白表达量

4 ℃条件下收集适量细胞，参照RIPA裂解液说明书步骤提取总蛋白，取少量蛋白应用BCA法测定蛋白浓度。配制8% SDS-PAGE分离胶与5%浓缩胶，20 ng各组蛋白上样电泳，转至0.45 μm PVDF 膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h, 加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，洗膜后，加入二抗(1∶2 000)室温孵育60 min后通过ECL显影曝光。

统计学分析

运用SPSS 26.0或GraphPad Prism 9软件进行统计学分析。采用曼-惠特尼U检验对队列3中正常人和AML患者的IGF2BP3表达量均数进行假设检验。同时采用曼-惠特尼U检验对队列1中难治性AML及其他AML患者、髓外浸润AML患者及无髓外浸润AML患者中的IGF2BP3表达量均数进行假设检验。以IGF2BP3表达量四分位数为界值将队列2分为高表达组和低表达组，研究基因表达水平与临床特征、分子学特征的关系。分别采用Fisher精确概率和Wilcoxon秩和检验进行分类变量和连续变量的假设检验。采用Kaplan-Meier法分析IGF2BP3表达水平与EFS、OS之间的关系并采用log-rank检验。利用多变量Cox比例危险模型研究IGF2BP3基因表达水平与OS、EFS在其他已知危险因素存在时的相关性。将单变量分析中P≤0.10的因素纳入多变量Cox回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

IGF2BP3基因在AML患者及AML难治患者中表达量的差异

本研究对本中心27例AML患者的骨髓原代白血病细胞进行转录组高通量测序及临床信息分析发现，在难治性AML患者(n=11)中，IGF2BP3表达量显著高于化疗敏感的AML患者(P=0.0343),qPCR结果表明，IGF2BP3 mRNA表达水平在难治复发患者显著增高(P=0.0020)(图1A-B);在白血病细胞髓外浸润患者(n=5)中，IGF2BP3基因表达量显著高于无髓外浸润(Non-EMI)的AML患者(P=0.0049)(图1C)。接着通过对GSE9476数据集的20例健康供者和26例急性髓系白血病患者的RNA-seq分析发现，IGF2BP3在AML患者中的表达水平显著高于健康对照者(P=0.0009)(图1D)。

IGF2BP3在蒽环类耐药细胞系中的表达

RT-qPCR检测HL60、K562细胞系及其蒽环类耐药细胞系HL60/ADR、K562/ADR中IGF2BP3 mRNA的水平。结果显示，与K562细胞组相比，K562/ADR细胞中 IGF2BP3 mRNA的表达水平显著增高(P=0.0430)(图2A),在HL60和HL60/ADR中无统计学差异(P=0.7369)。Western blot 检测结果显示，HL60/ADR、K562/ADR细胞中 IGF2BP3蛋白表达水平高于对应敏感细胞 (均P<0.001)(图2B-C)。

AML患者中IGF2BP3高、低表达组的临床及分子生物学特征

以IGF2BP3表达量的四分位数作为截断值，将TCGA数据集中的163例(已去除预后良好的M3型)初治AML患者分为高、低表达组，并进行临床及分子生物学特征分析。研究发现，低表达组中FAB分型中的M0患者更少(P=0.032),而患者性别、年龄、外周血白细胞计数、原始白细胞计数和骨髓原始幼稚细胞比例中两组间无显著差异。分子生物学特征分析中，融合基因RUNX1-RUNX1T1的患者数在IGF2BP3低表达组更多(P=0.000)。IGF2BP3高表达组RUNX1(P=0.026)、DNMT3A(P=0.005)突变的病例数显著高于低表达组，其余突变基因在两组间无显著差异。在高表达组中BAALC(P=0.008)、MN1(P=0.001)、ATP1B1(P=0.008)、TCF4(P=0.000)、P2RY14(P=0.021)这些基因出现高表达的概率显著增加。两组的化疗和移植方案没有显著差异。采用NCCN预后危险度分级指南对此数据集进行危险度分级，两组间无统计学差异(表1)。

IGF2BP3高表达与AML预后的关系

分析了TCGA数据库中163例AML病人IGF2BP3表达水平与无事件生存率(EFS)、总生存率(OS)的关系。结果显示，IGF2BP3低表达组中位EFS、OS分别为29.25和35.38个月，高表达组中位EFS、OS分别为17.13和22.67个月，表明IGF2BP3高表达组的EFS、OS率显著低于低表达组(EFS: 48.34% vs 75.95%,P=0.0259; OS: 50.00% vs 67.50%,P=0.0039)。利用GSE6891数据库中的420例AML样本进行验证，同样证实了IGF2BP3高表达组的EFS、OS率显著低于低表达组(EFS: 34.29% vs 49.13%,P=0.0086;OS: 51.43% vs 62.80%,P=0.0074)。进一步对GSE12417数据集中163例AML样本进行分析，结果显示，IGF2BP3高表达组的OS显著低于低表达组(41.22% vs 60.66%,P=0.0295)(图3)。

影响预后的多因素分析

本研究对TCGA数据集中163例患者数据信息进行Cox多因素回归模型分析。经多因素矫正后，IGF2BP3高表达与较低的EFS(HR=1.877,P=0.024)和OS(HR=1.619,P=0.016)显著相关。同时提示其他预后较差的因素包括：较高的外周血幼稚细胞数(EFS:HR=1.108,P=0.004),FHL1高表达(EFS:HR=1.979,P=0.006),较高的NCCN风险分级(OS:HR=1.724,P=0.000),年龄>60岁(OS:HR=2.071,P=0.000),DNMT3B高表达(OS:HR=1.487,P=0.048)。

三、讨论

本研究基于本中心27例AML的高通量测序数据进行分析，结果显示，在难治性AML及髓外浸润的AML患者中IGF2BP3表达量明显增高，并通过RT-qPCR 、Western blot检测AML病人样本、细胞系及其对应蒽环类耐药细胞系进一步验证其明显高表达。通过对746例AML患者的临床特征及生物学信息进行了多维度的分析，揭示了IGF2BP3基因高表达在AML患者中的预后价值，证实其高表达是AML预后生存的独立危险因素。

研究表明，急性髓系白血病发病与表观遗传学的调控密切相关[12,13]。DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DMNT)、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)等表观遗传学基因靶点的深入研究和临床应用，补充了预后分层体系，新增了治疗靶点，使AML患者的疾病缓解率和长期生存得到了显著改善[3,14,15,16]。胰岛素样生长因子II mRNA结合蛋白(IGF2BPs)作为一种RNA甲基化阅读相关蛋白在受精卵和胚胎阶段呈现出高表达，在成年后表达量逐渐降低，是一种癌胚蛋白[10]。IGF2BPs均具有致癌作用，其致癌功能依赖于它们作为m6A阅读相关蛋白的作用，通过稳定致癌靶点(例如MYC)的甲基化mRNAs实现。敲除单个IGF2BP可以显著抑制MYC的表达，并抑制癌细胞的增殖、克隆形成能力及肿瘤细胞的迁移、侵蚀[9,17,18]。胰岛素样生长因子-II mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)是IGF2BP家族的成员之一，是一种69 kDa的蛋白质，主要定位于细胞质[9]。在血液病恶性肿瘤中，IGF2BP3的高表达与套细胞淋巴瘤和慢性髓系白血病原始细胞的增殖特征有关[19]。研究者对B-ALL儿童患者的骨髓样本进行免疫染色，发现IGF2BP3在B-ALL急性期表达，但在缓解期患者骨髓中未见IGF2BP3表达[20]。另一项对BCR/ABL1阳性的ALL病例的研究发现IGF2BP3水平的持续升高比BCR/ABL1转录本增加和最终疾病复发提前3个月出现，提示，IGF2BP3可能和肿瘤的复发有关，并有希望成为肿瘤复发的监测靶点[21]。但IGF2BP3在AML中是否也起到同样的致癌作用尚未有报道。

本研究结果显示，IGF2BP3在AML患者中的表达量显著高于正常人群。研究表明，除纤维母细胞、淋巴细胞及睾丸外，IGF2BP3在成人组织中几乎不表达，但在各种肿瘤和肿瘤来源的细胞中从头合成或明显上调[10],本研究结果与文献报道一致。IGF2BP3在肺癌、乳腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤和卵巢透明细胞癌等多种癌症细胞中过表达，并与多种恶性肿瘤的预后不良和侵袭性相关[18,22,23,24,25,26,27]。本研究通过3个独立队列进行了验证，结果显示，IGF2BP3高表达患者具有更短的总生存时间及更短的无事件发生时间，并且进一步COX多因素分析证实IGF2BP3的高表达是AML的独立危险因素，提示，在AML患者中IGF2BP3表达量的增高与其不良预后相关，其表达量有望成为新的AML不良预后的监测靶点。

此外，一些研究表明包括IGF2BP3在内的IGF2BPs与肿瘤细胞的化疗抵抗相关。IGF2BPs可以通过抑制恶劣环境下的mRNA降解或增强mRNA的存储来促进其稳定性，并促进它们的翻译[9]。另一项研究的体外实验也证明，在慢性髓系白血病细胞(K562细胞)中敲除IGF2BP3 可增强K562细胞抗γ射线诱导凋亡的能力[28]。本研究对本中心临床数据库研究结果显示，IGF2BP3在难治性AML患者中的表达显著增高，通过RT-qPCR 、Western blot检测进一步验证其在难治AML病人样本及蒽环类耐药细胞系中高表达。表明，IGF2BP3表达量的增高可能与AML患者耐药相关，原因可能是提高了白血病细胞的化疗抵抗[9],提示，其表达水平在AML患者的诊断及难治AML预测中具有良好前景，对早期识别高危复发患者有重要意义。本研究还发现，IGF2BP3表达量在髓外浸润的AML患者中显著增高，这可能与AML侵袭性相关，促进肿瘤细胞向其他部位浸润，影响疾病预后，与既往文献报道结果一致[10]。

美国国立综合癌症网络(NCCN)和欧洲康白血病协作网(ELN)指南主要根据细胞遗传学(Cytogenetics)和分子生物学(Molecular biology)分型将AML进行预后分层，以指导AML患者治疗方案的选择。但AML预后危险度分层不能适用于所有患者，例如NCCN/ELN指南中AML-t(8;21)患者属于预后良好，选择大剂量化疗后仍具有较高的复发率[29]。因此，寻找更多的基因标志物对患者进行更精准的预后分层具有重要治疗指导意义。本研究报道了IGF2BP3基因在难治AML患者中高表达，是初治AML患者预后的独立危险因素，提示，其有望成为AML诊断、治疗效果的预测靶点。进一步研究IGF2BP3基因不同表达水平在AML发病、复发、耐药及预后中的机制，将为AML患者的化疗疗效的评估提供新的标志物，同时对AML的精准治疗提供重要的线索。

基金资助:国家自然科学基金(82270162,82270224,82070178);北京市自然科学基金(7222175);军队卫勤保障能力创新与生成专项(21WQ034);保健专项科研课题重点项目(21BJZ30);国家重点研发计划(2021Y FA 1100904);

文章来源:乐凝,杨晶晶,刘宇辰,等.IGF2BP3基因表达水平在急性髓系白血病患者中的预后价值[J].中国实验血液学杂志,2024,32(02):355-364.