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紫草素对人早幼粒细胞白血病细胞自噬和凋亡的影响

2024-04-03 43 上传者：管理员

摘要：目的：探讨紫草素对人早幼粒细胞白血病细胞自噬和凋亡的影响及可能的机制。方法：取对数生长期的人早幼粒细胞白血病细胞NB4，将其分为对照组（未处理的NB4细胞）、紫草素组（0.3μmol/L紫草素处理）、740Y-P组（15μmol/L PI3K/Akt/m TOR通路激活剂740Y-P处理）、紫草素+740Y-P组（0.3μmol/L紫草素与15μmol/L 740Y-P共同处理），处理24 h后，用于后续实验，CCK-8法检测各组细胞活力，单丹磺酰戊二酸染色检测细胞自噬囊泡的聚集情况，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blot检测各组细胞中Beclin1、LC3、p62、Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2及PI3K/Akt/m TOR通路相关蛋白的表达。结果：与对照组比较，紫草素组NB4细胞内紫色点状荧光强度、细胞凋亡率及Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、cleaved caspase-3、Bax蛋白相对表达量升高，OD450值（24、48 h）及Bcl-2、p62蛋白相对表达量降低（均P<0.05）；与对照组比较，740Y-P组NB4细胞内紫色点状荧光强度、细胞凋亡率及Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、cleaved caspase-3、Bax蛋白相对表达量降低，OD450值（24、48 h）及Bcl-2、p62蛋白相对表达量升高（均P<0.05）；与紫草素组比较，紫草素+740Y-P组NB4细胞内紫色点状荧光强度、细胞凋亡率及Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、cleaved caspase-3、Bax蛋白相对表达量降低，OD450值（24、48 h）及Bcl-2、p62蛋白相对表达量升高（均P<0.05）。与对照组比较，紫草素组NB4细胞中PI3K/Akt/m TOR通路相关蛋白p-PI3K、p-Akt、p-m TOR蛋白表达显著降低，而740Y-P组显著升高（均P<0.05）；与紫草素组比较，紫草素+740Y-P组NB4细胞中p-PI3K、p-Akt、p-m TOR蛋白表达显著升高（均P<0.05）。结论：紫草素可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路促进NB4细胞自噬与凋亡。

关键词：
早幼粒细胞白血病
磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路
紫草素
细胞凋亡
自噬
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早幼粒细胞白血病是髓系白血病的一种类型，其主要特征是15号和17号染色体之间的特征性平衡染色体易位，导致PML与RARA基因融合，产生PML-RARA融合蛋白，PML-RARA融合蛋白通过调控下游基因使白血病细胞分化阻滞在早幼粒阶段，同时抑制白血病细胞的凋亡[1]。自噬是控制各种生理过程的主要细胞分解代谢途径之一，包括参与自我更新、分化和死亡的过程。相关研究表明，自噬在早幼粒细胞白血病的发生发展中扮演着重要的角色[2]。尽管目前对早幼粒细胞白血病的治疗已经取得了巨大的进步，但预后仍不佳，因此，开发新药具有重要意义。紫草素是中药的主要活性成分之一，研究表明，紫草素通过靶向galectin-1/JNK信号轴诱导结直肠癌细胞凋亡和自噬，发挥抗肿瘤作用[3]。红景天苷通过抑制PI3K/Akt/m TOR通路抑制胃癌细胞的凋亡和保护性自噬[4]。本研究主要探究紫草素对人早幼粒细胞白血病细胞自噬和凋亡的影响以及其作用机制。

一、材料与方法

试剂与仪器

紫草素（纯度≥98%）购自北京迈瑞达科技有限公司；PI3K/Akt/m TOR通路激活剂740Y-P购自广州伟然生物科技有限公司；CCK-8试剂盒、BCA试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；细胞自噬染色检测试剂盒[单丹磺酰戊二酸法（MDC法）]购自北京雷根生物技术有限公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；Beclin1、LC3、p62、Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、p-m TOR、PI3K、Akt、m TOR、GAPDH兔多克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗均购自广州复能基因有限公司。二氧化碳培养箱购自上海润度生物科技有限公司；Tecan酶标仪购自勒菲生物科技（上海）有限公司；徕卡DMi 3000倒置荧光显微镜购自武汉中博生物公司。

细胞培养与分组

人早幼粒细胞白血病细胞NB4购自上海冠导生物工程有限公司。将NB4细胞置于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于37℃、5%CO2的条件下培养，定期更换培养液，并进行常规传代培养。取对数生长期的NB4细胞，参照文献[5,6]及前期预实验结果，将其分为对照组（未处理的NB4细胞）、紫草素组（0.3µmol/L紫草素处理）、740Y-P组（15µmol/L PI3K/Akt/m TOR通路激活剂740Y-P处理）、紫草素+740Y-P组（0.3µmol/L紫草素与15µmol/L740Y-P共同处理），处理24 h后，用于后续实验。

CCK-8法检测NB4细胞活力

调整各组细胞浓度为5×104/ml，取100µl加入到96孔板中。然后用对应的药物处理细胞，每个处理设置6个复孔。分别在药物处理的0、24、48 h时，将10µl CCK-8试剂加入到各个孔中，孵育2 h后，用酶标仪检测450 nm处的吸光度。

MDC染色检测各组细胞自噬囊泡的聚集情况

收集各组NB4细胞，以1×105/孔的密度加入到6孔板中，在培养箱中培养24 h后，除去培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，再加入适量的MDC染色液，37℃条件下避光染色20 min，用PBS洗3次，利用collection buffer重悬细胞，将细胞悬液滴于载玻片上并盖上盖玻片，荧光显微镜下观察，若细胞内出现紫色点状染色则为阳性。

流式细胞术检测NB4细胞凋亡

将各组细胞用PBS洗涤后，将其重悬于结合缓冲液中，并用5µl Annexin V-FITC和5µl碘化丙啶在4℃下避光染色30 min。染色后的细胞用结合缓冲液洗涤3次以去除多余的染料，然后将细胞重悬于500µl结合缓冲液中，使用流式细胞术分析细胞凋亡率。细胞凋亡率=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%。

Western blot检测NB4细胞中蛋白表达

用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白后，用BCA试剂盒对蛋白质进行定量。蛋白经过电泳、转膜、封闭后，将PVDF膜与一抗Beclin1(1∶1 000）、LC3(1∶1 000）、p62(1∶2 000）、Bax(1∶500）、cleaved caspase-3(1∶1 000）、Bcl-2(1∶1 000）、p-PI3K(1∶500）、p-Akt(1∶2 000）、p-m TOR(1∶2 000）、PI3K(1∶2 000）、Akt(1∶1 000）、m TOR(1∶1 000）、GAPDH(1∶1 000）在4℃下孵育过夜。洗膜3次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶500）在室温下孵育1 h。使用ECL化学发光试剂盒来可视化免疫印迹，以GAPDH为内参，通过Image J软件对目的蛋白条带的灰度值进行分析。

统计学分析

使用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析，数据以平均值±标准差的形式表示，多组间数据比较使用单因素方差分析，进一步两组间比较使用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

各组NB4细胞活力比较

与对照组比较，紫草素组NB4细胞在24、48 h时的OD450值显著降低，而740Y-P组显著升高（均P<0.05）；与紫草素组比较，紫草素+740Y-P组NB4细胞在24、48 h时的OD450值显著升高（均P<0.05）（表1）。

各组NB4细胞自噬能力比较

MDC染色结果显示，与对照组比较，紫草素组NB4细胞内紫色点状荧光强度显著增强，而740Y-P组显著减弱；与紫草素组比较，紫草素+740Y-P组NB4细胞内紫色点状荧光强度显著减弱（图1）。Westernblot结果显示，与对照组比较，紫草素组NB4细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1蛋白相对表达量升高，p62蛋白相对表达量降低，740Y-P组NB4细胞中Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达显著降低，p62蛋白表达水平显著升高（均P<0.05）；与紫草素组比较，紫草素+740Y-P组NB4细胞中Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达显著降低，p62蛋白表达水平显著升高（均P<0.05）（图2，表2）。

各组NB4细胞凋亡率及凋亡相关蛋白水平比较

与对照组比较，紫草素组NB4细胞凋亡率、cleaved caspase-3、Bax蛋白相对表达量升高，Bcl-2蛋白相对表达量降低，740Y-P组NB4细胞凋亡率、cleaved caspase-3、Bax蛋白相对表达量降低，Bcl-2蛋白相对表达量升高（均P<0.05）；与紫草素组比较，紫草素+740Y-P组NB4细胞凋亡率、cleaved caspase-3、Bax蛋白相对表达量降低，Bcl-2蛋白相对表达量升高（均P<0.05）（图3-4，表3）。

各组NB4细胞中PI3K/Akt/m TOR通路相关蛋白表达比较

与对照组比较，紫草素组NB4细胞中p-PI3K、p-Akt、p-m TOR蛋白表达显著降低，而740Y-P组显著升高（均P<0.05）；与紫草素组比较，紫草素+740Y-P组NB4细胞中p-PI3K、p-Akt、p-m TOR蛋白表达显著升高（均P<0.05）（图5，表4）。

三、讨论

早幼粒细胞白血病病情凶险，恶性程度高[7]。诱导细胞凋亡，促进保护性自噬是目前治疗恶性肿瘤的常用方法之一。早幼粒细胞白血病细胞对药物的抗性使治疗变得困难重重，因此，寻找高效的药物成为目前的研究重点。

紫草素是紫草的主要成分，属于萘醌类化合物，具有广泛的生物活性，如促进伤口愈合、抗炎、抗病毒、抗癌等[8,9]。近年来，研究者对紫草素的抗癌作用进行了广泛的研究。王军等[10]发现，紫草素能够促进人结肠癌SW480细胞凋亡和自噬；邵鑫等[11]报道，紫草素可诱导人结肠癌细胞HCT116发生凋亡，并激活其自噬途径；孙艳华等[12]研究表明，紫草素通过激活ATG7信号通路诱导人结肠癌细胞系SNU-407细胞凋亡和自噬；Wang等[13]报道，紫草素对肺腺癌的抑癌作用是通过抑制细胞生长、阻滞细胞周期、激活自噬和诱导细胞凋亡来实现的。LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin1、p62为典型的自噬标志性蛋白。当自噬启动时，Beclin1具有控制自噬小体形成的作用[14]。在自噬激活过程中，LC3-Ⅰ被加工转换为LC3-Ⅱ，随着自噬体的形成增加，LC3-Ⅰ蛋白转换成LC3-Ⅱ蛋白的数量增多，可通过LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值来衡量自噬活性，而p62可参与自噬体的降解过程，其蛋白表达量越高，表明自噬抑制越强[15]。本研究结果显示，与对照组比较，紫草素组NB4细胞活力降低，细胞内紫色点状荧光强度显著增强，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1蛋白相对表达量升高，p62蛋白相对表达量降低，提示紫草素在NB4细胞中具有激活自噬的作用。Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2是细胞凋亡的关键标志性蛋白，研究表明，Bax是一种促凋亡蛋白，可破坏线粒体膜的完整性，增加细胞色素C释放及caspase-3的活化，活化的caspase-3可放大细胞内的凋亡信号进而诱导细胞凋亡，而Bcl-2具有维护线粒体膜的完整性、抑制细胞凋亡的作用[16]。本研究结果显示，与对照组比较，紫草素组NB4细胞凋亡率、cleaved caspase-3、Bax蛋白相对表达量升高，Bcl-2蛋白相对表达量降低，提示紫草素可诱导NB4细胞凋亡。

PI3K/Akt/m TOR信号通路可以调节肿瘤细胞的凋亡和自噬，因此，抑制PI3K信号传导目前被认为是开发治疗肿瘤药物的主要目标之一[17]。文献报道，阿帕替尼可以通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路诱导细胞凋亡和自噬，用于治疗乳头状甲状腺癌[18]；白花丹醌可抑制结肠癌细胞活力，并诱导细胞凋亡与自噬，其机制与抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路有关[19]；隐丹参酮可通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路诱导肝癌细胞自噬，并降低细胞活力[20]。本研究结果显示，紫草素可明显下调NB4细胞中PI3K、Akt、m TOR蛋白的磷酸化水平，推测紫草素诱导NB4细胞自噬与凋亡可能与PI3K/Akt/m TOR通路有关。为了验证该推测，本研究利用PI3K/Akt/m TOR通路激活剂740Y-P进行干预，结果显示，740Y-P组NB4细胞中PI3K、Akt、m TOR蛋白的磷酸化水平显著高于对照组，细胞自噬受到抑制，细胞活力及细胞凋亡能力显著减弱，表明紫草素可能通过抑制PI3K/Akt/m TOR通路促进NB4细胞自噬与凋亡。与紫草素组比较结果显示，紫草素+740Y-P组NB4细胞中p-PI3K、p-Akt、p-m TOR蛋白表达显著升高，细胞活力增强，细胞自噬与凋亡受到抑制，进一步表明紫草素可能通过抑制PI3K/Akt/m TOR通路促进NB4细胞自噬与凋亡。

综上所述，紫草素可能通过抑制PI3K/Akt/m TOR通路促进NB4细胞自噬与凋亡，本研究结果为早幼粒细胞白血病的治疗提供了新的理论依据。未进行体内动物实验以进一步验证该结论是本研究的不足之处，后续将通过实验进一步深入探讨。

参考文献:

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[10]王军,杨雅娟,刘海涛,等.紫草素抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路诱导人结肠癌SW480细胞凋亡和自噬的作用研究.药物评价研究,2021,44(2):338-343.

[11]邵鑫,蒋先虹,王瑞,等.紫草素对人结肠癌细胞HCT116自噬和凋亡的影响.中国药房,2021,32(1):51-55.

[12]孙艳华,李明,徐建立,等.紫草素通过激活自噬相关的E1连接酶7信号通路诱导结肠癌细胞自噬.安徽医药,2020,24(12):2336-2342,2545.

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[19]刘欢,梁丽英,刘显,等.白花丹醌对人结肠腺癌Caco-2细胞凋亡､自噬及PI3K/Akt/m TOR信号通路的影响.中国病理生理杂志,2021,37(2):255-262.

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