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下调ATM/hnRNPK信号降低髓系白血病细胞阿霉素耐药

2024-11-29 30 上传者：管理员

摘要：目的探索共济失调毛细血管扩张突变蛋白(ATM)/核内不均一的核糖核蛋白K(hnRNPK)信号在调控细胞自噬参与髓系白血病细胞阿霉素耐药中的作用机制。方法用Western blot法检测ATM在阿霉素敏感和耐药细胞株中的表达水平差异。ATM抑制剂及RNA干扰技术抑制ATM在耐药株中的表达水平。在ATM表达调变前后，使用CCK8法检测耐药细胞株对阿霉素药物敏感性，以及使用Western blot法检测人微管相关蛋白轻链3Ⅰ/Ⅱ(LC3Ⅰ/Ⅱ)及hnRNPK的表达水平。结果 ATM在阿霉素耐药细胞株中的表达水平较敏感株明显增高，ATM抑制剂及RNA干扰法降低ATM的表达水平后，耐药株对阿霉素的敏感性可以恢复，且自噬蛋白LC3Ⅱ及hnRNPK的表达与ATM的表达变化一致。结论 ATM/hnRNPK信号异常调控细胞自噬参与髓系白血病细胞阿霉素耐药。

关键词：
AML
ATM/hnRNPK
白血病
细胞自噬
阿霉素
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儿童急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)的治疗仍以化疗为主，蒽环类药物依然具有重要地位，化疗药物耐药是影响急性髓系白血病临床疗效和预后的关键因素，而细胞自噬是调控白血病细胞耐药的重要机制[1]。课题组既往的研究结果发现，髓系白血病阿霉素(adriamycin, ADM)耐药与不均一的核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,hnRNPK)的过表达及细胞自噬水平升高相关[2-3],文献及生物信息学挖掘发现共济失调毛细血管扩张突变蛋白(ataxia-telangiectasia mutated, ATM)可能是调控 hnRNPK 的上游分子[4-5],因此推测，ATM/hnRNPK信号可能在调控细胞自噬及形成白血病细胞阿霉素耐药机制中发挥作用。在耐药的髓系白血病细胞中ATM/hnRNPK信号高表达，调控细胞自噬为优势状态，使白血病细胞可以通过自我更新抵抗化疗药物杀伤作用形成耐药表型。本文拟从细胞株中观察ATM的表达水平变化与细胞自噬及白血病细胞阿霉素耐药的关系，调变ATM的表达后检测hnRNPK的表达变化以明确ATM/hnRNPK的上下游关系，并进一步观察ATM/hnRNPK信号的表达变化对自噬及白血病细胞阿霉素耐药的逆转程度。

1、材料与方法

1.1 细胞与试剂

野生型人早幼粒白血病细胞系HL60, 阿霉素耐药的HL60细胞株HL60/ADM, 野生型人慢性粒细胞白血病细胞系K562和阿霉素耐药的K562细胞株K562/ADM(均为广东省人民医院儿科培养);CCK8试剂(碧云天生物技术公司);兔抗人ATM、hnRNPK、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain, LC3)Ⅰ/Ⅱ、甘油醛3磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydroge-nase, GAPDH)及辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)标记的羊抗兔二抗抗体(Cell Signaling公司);转染试剂X-treme GENE siRNA(罗氏公司);自噬抑制剂3甲基腺嘌呤(3-methyladen-ine, 3-MA)、巴弗洛霉素A1(bafilo-mycin A1,Baf-A1)以及ATM抑制剂KU-55933(Abcam公司);RPMI-1640培养基(Gibco公司);RNA提取试剂TRIzol、反转录PrimeScript RT reagent Kit、PCR反应试剂SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa公司);siRNA ATM(invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及分组处理：

将K562,HL60细胞培养于10%胎牛血清RPMI-1640细胞培养液，置37 ℃、5% CO2培养箱，K562/ADM,HL60/ADM细胞中则常规加入0.8 μg/mL ADM培养，收集对数增殖期细胞进行实验。RNA干扰法建立低表达ATM的K562/ADM和HL60/ADM细胞株：将(1～4)×105细胞接种于6孔板，细胞贴壁率在24 h后可达70%～90%,将X-treme GENE siRNA转染试剂用无血清培养基稀释，并按照5∶1比例和ATM siRNA混合，转染试剂/siRNA复合物(200 μL,转染浓度50 nmol/L)制备后，加入6孔板中并进行37 ℃ 24 h孵育，更换胎牛血清培养基，继续培养3～8 h, PCR及Western blot检测ATM的表达水平，命名为K562/ADM-ATM-siRNA,HL60/ADM-ATM-siRNA,相应空白干扰对照组为：K562/ADM-control-siRNA,HL60/ADM-control-siRNA。ATM抑制剂KU-55933作用浓度为10 μmol/L,自噬抑制剂3-MA作用浓度为5 mmol/L,自噬抑制剂Baf-A1作用浓度为10 nmol/L。

1.2.2 Western blot检测ATM, hnRNPK, LC3Ⅰ/Ⅱ表达：

参照Bio-Rad仪器操作手册，进行12% SDS-PAGE电泳，上样量为80 μg, 5% BSA封闭1 h后，分别与抗ATM, hnRNPK, 抗LC3Ⅰ/Ⅱ和抗GAPDH抗体4 ℃孵育过夜。加HRP标记的二抗后在暗室曝光和显影。经凝胶成像系统扫描各电泳条带，读取吸光度代表蛋白质的含量。校正结果为目标蛋白与内参GAPDH的比值，以均数±标准差表示。

1.2.3 荧光定量PCR检测ATM/hnRNPK表达：

收集对数增殖期细胞，TRIzol法提取总RNA(3×107细胞/mL),反转录为cDNA,荧光定量PCR反应使用SYBR Premix Ex Taq体系，按说明书执行，上机ABI7500 PCR仪检测，反应条件为：95 ℃ 5 s, 60 ℃ 45 s, 40个循环。GAPDH为内参。

1.2.4 CCK8法检测细胞活力：

按照CCK8试剂进行操作，将各组细胞加入96孔板，每孔细胞数调整为5×104/100 μL,孵育24 h后，加入梯度浓度阿霉素(0～62.5 μg/mL),48 h检测细胞活力，细胞抑制率按公式[1-(Atreated-Ablank)/(Acontrol-Ablank)]×100%计算。加入二甲基亚砜处理及未处理细胞均作为对照组。

1.3 统计学分析

数据处理使用SPSS 13.0统计软件，各组数据以均数±标准差

表示，2组之间的比较，如果方差不齐，使用t′检验，如果方差齐，使用t检验，多组之间的比较，如果方差不齐，用近似Welch法，如果方差齐，则用单因素方差分析。组内多重比较，如果方差不齐则用Dunnett′s T3法，如果方差齐采用LSD法。

2、结果

2.1 ATM在阿霉素耐药白血病细胞株中过表达

耐药株K562/ADM,HL-60/ADM中ATM表达量显著高于野生型K562,HL-60细胞(P<0.05)(图1A～D)。

2.2 阿霉素耐药白血病细胞株中自噬增强，抑制自噬水平后ATM/hnRNPK表达降低

阿霉素耐药的K562/ADM,HL60/ADM细胞中，LC3Ⅱ的表达量显著高于野生型K562,HL60细胞(图2A～C)(P<0.05)。自噬抑制剂3-MA以及Baf-A1可以减低耐药株K562/ADM、HL60/ADM中LC3Ⅱ表达水平，3-MA以及Baf-A1作用下检测ATM及hnRNPK的表达，结果在耐药株K562/ADM、HL60/ADM中，ATM及hnRNPK表达水平降低(图2A～C)(P<0.05)。

2.3 下调ATM表达后hnRNPK和LC3Ⅱ表达降低

K562/ADM-ATM-siRNA、 HL60/ADM-ATM-siRNA细胞株中ATM表达较K562/ADM、HL60/ADM细胞株减低，较空白对照K562/ADM-control-siRNA、HL60/ADM-control-siRNA细胞株减低(图3A,C～E)(P<0.05)。与K562/ADM和HL60/ADM细胞系比较，hnRNPK及自噬蛋白LC3Ⅱ在K562/ADM-ATM-siRNA及HL60/ADM-ATM-siRNA细胞株中表达均降低(P<0.05),而在K562/ADM-control-siRNA及HL60/ADM-control-siRNA细胞株中表达无明显变化(图3B,C～E)(P>0.05)。

图1 Western blot法检测p-ATM在各细胞株中的表达水平

图2 ATM,hnRNPK,LC3Ⅰ/Ⅱ在各细胞株中的蛋白表达水平以及3-MA/Baf-A1作用后的表达变化

ATM激酶抑制剂KU55933抑制耐药株中ATM的表达，与K562/ADM和HL60/ADM细胞株比较，hnRNPK及自噬蛋白LC3Ⅱ在K562/ADM-KU55933及HL60/ADM-KU55933细胞株中表达均降低(图3B,C～E)(P<0.05)。

2.4 下调耐药细胞株中ATM表达后药物敏感恢复

相同阿霉素浓度处理24 h, 相比K562/ADM和HL60/ADM细胞，K562/ADM-ATM-siRNA、K562/ADM-KU55933、HL60/ADM-ATM-siRNA、HL60/ADM-KU55933细胞株的细胞活力明显下降，即对于阿霉素的药物敏感性有所恢复(P<0.05),而在K562/ADM-control-siRNA以及HL60/ADM-control-siRNA的细胞活力无明显变化(图4)。

图3 各细胞株在ATM表达调变前后hnRNPK以及LC3Ⅰ/Ⅱ的表达变化

图4 CCK8法检测各细胞株ADM敏感性

3、讨论

目前，蒽环类药物耐药是影响儿童急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)预后的主要因素，难治性白血病长期生存率仍只有50%左右[6]。白血病细胞耐药机制复杂，至今未完全阐明，已知包括骨髓微环境异常，细胞粘附异常、凋亡受阻等[7]。

ATM蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，分子量约为350 ku, 属于磷脂酰肌醇激酶样蛋白激酶(phosphatidylinositol 3 kinase-like kinase, PIKK)家族[8-9]。研究提示， ATM参与DNA损伤修复、细胞周期调控、细胞凋亡等一系列生物学过程[10]。ATM蛋白还可参与氧化还原平衡、调控Ca2+与K+的迁移、胰岛素信号途径、促进线粒体自噬等[11]。文献报道，细胞质内的ATM作为活性氧(reactive oxygen species, ROS)感受器，可降低雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)对自噬的抑制，促进自噬发生[12]。在肿瘤耐药研究中，ATM过表达是软组织肉瘤ATR抑制剂耐药的驱动因素，联合ATM及ATR抑制剂可逆转软组织肉瘤耐药[13]。

综上，ATM蛋白在自噬及肿瘤细胞耐药机制中均发挥作用，但其在白血病阿霉素耐药中的机制研究较少。

本课题组既往的研究提示，hnRNPK可能通过苄氯素1(Beclin 1)调节自噬水平，hnRNPK过表达与慢性粒细胞白血病伊马替尼耐药相关，与髓系白血病阿霉素耐药相关[14]。文献及生物信息学STRING数据库分析预测，ATM与hnRNPK可能相互作用[5],ATM/hnRNPK信号与髓系白血病阿霉素耐药机制值得进一步研究。本文以细胞株为研究对象，发现ATM蛋白在阿霉素耐药细胞株中过表达，且ATM过表达与自噬增强有关，下调ATM表达后，细胞株自噬减低及阿霉素耐药逆转，表明，ATM过表达是髓系白血病细胞阿霉素耐药的因素之一，可能与自噬增强有关。ATM调变前后hnRNPK的表达变化与其保持一致，与自噬蛋白LC3Ⅱ的表达一致，抑制自噬后，ATM/hnRNPK信号表达亦可降低，表明，ATM/hnRNPK信号轴表达增高对于自噬及耐药有增强作用，验证了ATM/hnRNPK信号与自噬及髓系白血病耐药相关性。但本研究结果局限于细胞株，仍需要动物实验及骨髓样本进一步验证。

综上，本文探索了ATM/hnRNPK信号调控细胞自噬及在髓系白血病阿霉素耐药中的作用，为克服髓系白血病阿霉素耐药提供了可能的新靶点。

参考文献:

[7]向彩霞,黄彬涛,郝建.抗凋亡抑制剂维奈克拉在治疗髓系白血病的研究进展[J].基础医学与临床,2023,43:833-836.

基金资助:广东省医学科研基金(A2022349);

文章来源:张进芳,钟明艳,杨泉,等.下调ATM/hnRNPK信号降低髓系白血病细胞阿霉素耐药[J].基础医学与临床,2024,44(12):1638-1643.