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水母毒素磷脂酶A2在水母蜇伤致炎中的作用分析

2024-08-14 5 上传者：管理员

摘要：目的:探究水母磷脂酶A2结构关系在水母蜇伤导致的全身炎症反应综合征中的作用。方法:基于沙海蜇、海月水母、安朵先水母、海蜇水母触手组织的转录组和蛋白组数据，利用生物信息学的分析手段对其理化性质、亲水性、信号肽、二级结构以及三级结构进行分析预测。结果:所得到的各类水母磷脂酶A2氨基酸序列，其蛋白主要以低分子量为特征，亲水性分析大部分蛋白都具有极好的亲水性特征，同时蛋白质二级结构和三级结构显示这些序列扭曲和折叠较多，丰富的结构特征对其生物活性发挥了重要作用。而通过STRING数据库构建蛋白互作网络发现磷脂酶A2序列都与PLA2G15、磷脂酶A2组Ⅲ(PLA2G3)、内收素1(ADD1)等蛋白质互相作用，该类蛋白质在各种炎症介质的产生中发挥了重要作用。结论:水母磷脂酶A2在水母蜇伤后导致的全身炎症反应综合征中可能是通过花生四烯酸等途径诱导了炎症反应，为水母蜇伤的治疗提供参考价值。

关键词：
全身炎症反应综合征
水母
水母蜇伤
生物信息学
磷脂酶A2
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水母作为一种重要的胶质状水生浮游生物，以水螅水母类、管水母类、钵水母类、栉水母类为主要群类[1]。水母于热带、温带水域、浅水区、淡水区等世界各大水域广泛分布，且存在时间悠久约有六亿五千万年[2]。由于全球变暖、过度捕捞等人类活动的影响，水母呈现爆发式增长，使蜇伤事件频发[3]。水母毒液中成分复杂，包括金属蛋白酶抑制剂、钾通道抑制剂、溶血素、磷脂酶A2等多种毒素，且不同品种水母的毒素种类也有区别[4-6]。

磷脂酶A2广泛分布在哺乳动物胰腺、有毒动物和其他来源的毒素中，分为分泌型、胞浆型、钙依赖型和血小板活化因子乙酰水解酶(又称脂蛋白相关磷脂酶A2)4种主要类型[7-9]。磷脂的sn-2位置通常包含多不饱和脂肪酸，在体内环境释放时，这些脂肪酸可以代谢形成各种二十碳烯酸和相关的生物活性脂质介质。剩余的溶血磷脂也可以在生物过程中发挥重要作用[10]。尽管有报道说磷脂酶A2是水母毒素中的主要成分之一，但针对磷脂酶A2的研究报道主要集中在蛇毒、蝎毒、蜂毒等动物，而针对海葵、水母等刺胞动物中的磷脂酶A2的相关研究报道还不够完善[11-12]。因此本文对采集和购买到的沙海蜇、海月水母、安朵先水母、海蜇的转录组蛋白组联合分析表进行查找分析，通过生物信息学的分析手段对其理化性质、亲水性、信号肽、二级结构以及三级结构进行分析预测，为水母磷脂酶A2的结构与功能关系提供理论基础。

1、材料与方法

将购买自上海海洋馆的海蜇、大西洋海刺、海月水母和捕捞于大连海域的沙海蜇等水母的触手剪下，提取其总RNA和蛋白质，通过质检合格后进行高通量的测序和质谱分析，用于后续构建各种水母触手组织的转录组和蛋白组数据。

通过对实验室中各种水母的转录组蛋白组联合分析表的查找，得到不同种类水母磷脂酶A2的氨基酸序列，并按照水母的种类不同进行分类。将所得到的序列通过Biodit和SnapGene软件进行多序列对比分析，采用MEGA7 Neighbor-Joining方法构建系统发育树。

将水母磷脂酶A2的氨基酸序列输入至在线工具数据库ExPASy ProtParam分析该蛋白质的理化性质。整理分析所得到的关于氨基酸组成、分子式、相对分子质量、理论等电点、消光系数、半衰期、不稳定系数、脂肪系数等信息。通过SignalP 5.0 Server软件判断该蛋白质信号肽存在与否。使用SOPMA在线工具分析该蛋白质二级结构，并用SWISS-MODEL在线工具预测该蛋白质三级结构特征。使用STRING数据库对水母磷脂酶A2进行蛋白互作分析。使用DAVID数据库对所得到的基因进行信号通路分析。

2、结果

2.1 水母磷脂酶A2序列的收集和进化分析

通过对实验室数据的查找，得到沙海蜇磷脂酶A2序列9条，海月水母磷脂酶A2序列11条，安朵先水母磷脂酶A2序列4条，海蜇中磷脂酶A2序列3条，大西洋海刺磷脂酶A2序列6条以及1条黑星海刺水母磷脂酶A2序列，共计34条序列。见图1。

图1 水母磷脂酶A2进化树

对上述34条序列进行多序列比对显示，上述序列在第124位半胱氨酸保守值为82%;在第125位甘氨酸保守值为75%;在第309位苯丙氨酸保守值为68%;在第197位和281位半胱氨酸保守值为67%;在第195位的组氨酸和第201位的甘氨酸的保守值分别为53%和52%。

采用JTT矩阵模型对水母磷脂酶A2序列采用1 000个重复分析，通过两两距离矩阵应用Neighbor-Join和BioNJ算法，之后选择对数相似值较高的拓扑结构。分析了涉及27个氨基酸序列，最终数据集中在13个位置从而构建出进化树。

2.2 水母磷脂酶A2的蛋白质一级结构分析

2.2.1 水母磷脂酶A2理化性质分析

通过ExPASy ProtParam在线工具获得水母磷脂酶A2的理化信息如表1所示。结果显示大部分的水母磷脂酶A2分子量主要集中在20 KDa范围内。其中，不稳定系数>40的蛋白，提示可能蛋白不稳定；<40则提示蛋白可能稳定。水母磷脂酶A2氨基酸序列经过分析显示不稳定系数>40和<40的各占一半左右，显示水母磷脂酶A2的稳定性蛋白和不稳定性蛋白种类都比较丰富。其中水母磷脂酶A2(TRINITY_DN5823_c0_g1)其分子量为16.8 KDa, 等电点值为8.72。带负电荷氨基酸残基数(Asp+Glu)为18个，带正电荷氨基酸残基数(Arg+Lys)为23个，通过该在线工具显示该磷脂酶A2不稳定系数为38.26(<40),显示该蛋白比较稳定。

通过ExPASy ProtParam在线工具对水母磷脂酶A2序列进行分析，其中亲水性评估中的负值表示亲水性，其值越小说明该蛋白质亲水性越强；反之，正值表示其疏水性，正值越大表示其疏水性越强。亲水性分析显示该类蛋白具有较好的亲水性是亲水性蛋白。表1所示水母磷脂酶A2序列其亲水性评估为负值，则显示该类蛋白为亲水性蛋白。

2.2.2 水母磷脂酶A2信号肽分析

信号肽是指引导新合成的蛋白质分泌通路转移的短肽链，长度为5～30个氨基酸。通过SignalP 5.0 Server软件预测水母磷脂酶A2的信号肽预测，其中有19条序列含有信号肽如图2所示，其余序列不含有信号肽。其中水母磷脂酶A2(TRINITY_DN5823_c0_g1)显示信号肽位置处于第1～16个氨基酸。

2.3 水母磷脂酶A2的蛋白质二级结构分析

使用SOPMA在线工具对水母的磷脂酶A2氨基酸序列进行二级结构预测，结果表明无规卷曲(Random coil)和α-螺旋(Alpha helix)是其主要构成元件。其中磷脂酶A2(TRINITY_DN5823_c0_g1)共147个氨基酸组成，其中α-螺旋由49个氨基酸构成，占总氨基酸数量的33.33%;β-折叠由2个氨基酸构成，占总氨基酸数量的1.36%;无规卷曲由78个氨基酸构成，占总氨基酸数量的53.06%;18个氨基酸形成延伸链，占比量为12.26%。其余水母磷脂酶A2序列的α-螺旋、β折叠、无规卷曲构成占比如表2所示。

2.4 水母磷脂酶A2的蛋白质三级结构分析

通过SWISS-MODEL在线工具(https: //www.swissmodel.expasy.Org/)预测水母磷脂酶A2序列的蛋白质三级结构特征，如图3所示，可见其扭曲和折叠较多，结构丰富，这对其生物学功能的发挥具有重要作用。

表1 水母磷脂酶A2蛋白质一级结构分析

图2 水母磷脂酶A2信号肽分析

表2 水母磷脂酶A2蛋白质二级结构分析

图3 水母磷脂酶A2的蛋白质三级结构分析

2.5 水母磷脂酶A2蛋白质互相作用分析

运用STRING数据库将水母磷脂酶A2序列用于构建相互作用的网络，如图4所示，发现相互作用的蛋白质主要包括磷脂酶A2第XV组(PLA2G15)、磷脂酶A2组Ⅲ(PLA2G3)、磷脂酶A2组1B(PLA2G1B)、内收素1(ADD1)和核糖体生物发生因子(BMS1)。研究表明PLA2G1B是一种嗜酸性磷脂酶，可催化细胞膜磷脂的磷脂酰胆碱脂发生水解，从而产生游离脂肪酸和溶解磷脂酰胆碱，在炎症反应、免疫调节等多个生理过程中发挥了重要作用[13]。PLA2G3该基因编码的蛋白质属于分泌型磷脂酶A2家族，其成员包括蜂毒酶。编码的酶在脂质代谢中发挥作用，并催化磷脂sn-2酰基键的钙依赖性水解，释放花生四烯酸和溶血磷脂[14]。这种酶作为纤毛生成的负调节剂，可能通过刺激肿瘤细胞生长和血管生成在癌症发展中发挥作用，同该酶与氧化应激与炎症有关。通过对水母磷脂酶A2蛋白质互作分析，结果显示其在诱导炎症方面可能发挥了重要作用。将所得到的核心靶点通过DAVID数据库分析，得到9条信号通路，所得到亚麻酸代谢信号通路、花生四烯酸通路、脂肪消化和吸收等信号通路如图5所示。其中花生四烯酸信号通路对于调节细胞凋亡、细胞增殖、细胞分化和炎症反应等多种生理过程的关键途径，说明磷脂酶A2序列可能与花生四烯酸信号通路等方式诱导炎症[15]。

图4 水母磷脂酶A2互相作用网络

图5 KEGG PATHWAY

3、讨论

由于全球气候变暖和人类海洋探索的增加，水母蜇伤风险不可忽视。研究表明水母蜇伤可造成心血管系统、呼吸系统和皮肤系统等损伤，蜇伤后常出现红肿、刺痛、灼烧感、丘疹状疱疹等临床表现，严重者会对呼吸系统和中枢神经系统造成抑制作用甚至是死亡[16]。水母毒素成分复杂，其中包含磷脂酶A2、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等，具有诱导炎症、神经毒性、溶血等多种生物毒性[17]。研究表明褐藻糖胶具有抑制水母毒素中磷脂酶A2的活性，且降低炎性因子的表达水平，在水母皮炎的治疗方面展现出巨大的潜力，这为水母蜇伤后的治疗起到参考作用[18]。研究表明曲克芦丁可以通过激活Nrf2/HO-1信号通路，从而降低水母毒素导致的细胞氧化损伤和炎症反应[19]。此外，通过分子动力学分析结果显示水飞蓟素可以有效抑制水母毒素中金属蛋白酶的活性，减少毒性对机体的影响水平[20]。由此表现天然化合物在水母蜇伤后的治疗方面具有重要前景。

通过对实验室中各种水母的转录组蛋白组联合分析表的查找，得到不同种类水母磷脂酶A2的氨基酸序列，结果显示水母中的磷脂酶A2蛋白主要以低分子量为特征，而亲水性评估为负数显示了其具有较好的水溶性特征。通过多序列比对显示，这些序列在124位半胱氨酸保守值为82%;在第125位甘氨酸保守值为75%;在第309位苯丙氨酸保守值为68%;在第197位和281位半胱氨酸保守值为67%;以及195位的组氨酸和201位的甘氨酸的保守值分别位53%和52%,同时蛋白质二级结构和三级结构分析显示这些序列扭曲和折叠较多，其结构丰富可能对其生物活性发挥了重要作用。运用STRING数据库将水母磷脂酶A2序列用于构建相互作用的网络，发现相互作用的蛋白质主要包括PLA2G15、PLA2G3、PLA2G1B、ADD1和BMS1。而其中PLA2G3催化花生四烯酸从细胞膜磷脂的释放，从而在各种炎症脂质介质的产生中发挥作用。因此通过对水母磷脂酶A2序列的生物信息学分析，推测其在炎症的发生中起到了重要作用，可能是通过花生四烯酸信号通路等方式诱导炎症的发生。通过对磷脂酶A2序列进行分析显示，其对炎症具有密切关系，目前针对水母蜇伤尚未有针对性的药物。现代研究表明天然化合物具有较强的抗炎[21]、抗氧化活性[22],研究证明其在水母蜇伤后的炎症反应中有较强的拮抗作用，这为临床上水母蜇伤的治疗起到了参考价值。

参考文献:

[21] 张国鹏,黄鑫,程序,等.热毒宁注射液治疗新型冠状病毒肺炎的临床疗效分析[J].临床急诊杂志,2023,24(10):506-511.

[22] 王世伟,吕丹,龚好,等.参附联合维生素C对脓毒性休克患者血管内皮损伤的保护作用研究[J].临床急诊杂志,2021,22(10):641-646.

基金资助:国家重点研发计划资助(No:2022-3.3);

文章来源:王增发,陈镜伯,杨凤玲,等.水母毒素磷脂酶A2在水母蜇伤致炎中的作用分析[J].临床急诊杂志,2024,25(08):413-419.