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EYA1基因变异的综合征家系临床表型和基因分析

2024-07-01 7 上传者：管理员

摘要：目的:研究一个鳃耳综合征(branchio-oto syndrome)家系临床表型，探寻该家系的遗传学病因。方法:收集1例诊为鳃耳综合征的患儿及家系成员的临床资料，提取先证者及其家系成员的外周血基因组DNA,进行全外显子组测序，并对突变位点进行Sanger测序验证分析。结果:该家系包括2代4人，其中3人有表型，2人听力下降，并且有双侧耳前瘘管，双侧鳃裂瘘，1人双侧耳前瘘，双侧鳃裂瘘，均符合鳃耳综合征的临床诊断，该家系遗传方式为常染色体显性遗传，基因检测显示该家系所有发病成员EYA1基因均有c.1744delC(p.L592Cfs*47)变异，表型正常成员该位点为野生型，家系内符合基因型与表型共分离。该突变为移码突变，导致终止密码子提前出现，该突变目前尚未见报道。根据美国医学遗传学与基因组学学会指南，该变异初步判定为疑似致病性变异。结论:该家系新发现的EYA1c.1744delC(p.L592Cfs*47)突变为该家系患者的致病突变基因，进一步拓展了EYA1基因的突变谱，使我们对于该病有了更新的认识，为临床诊断和遗传咨询提供了重要参考。

关键词：
DNA突变分析
EYA1基因
耳聋
遗传性聋
鳃耳综合征
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遗传性聋可根据是否存在其他系统的病变分为综合征性耳聋(30%)和非综合征性耳聋(70%)[1]。鳃耳综合征(branchio-oto syndrome, BOS)是一种少见的常染色体显性遗传性疾病，临床特点是听力障碍、耳部畸形、鳃裂异常[2]。鳃耳综合征是鳃耳肾综合征(branchio-oto-renal syndrome, BOR)的一种，BOS比较BOR仅在肾脏方面缺乏表现，其余情况相同。BOR最早于1975年由Melnickt等[3]报道，该病发病率为1/40 000,在重度及以上新生儿中的发病率为2%[4]。目前研究表明BOR综合征相关致病基因为EYA1(8q13.3)、SIXI(14q23.1)和SIX5(19q13.2),其中约40%的BORS综合征患者可以检测到EYA1基因突变，因此，EYA1被认为是最常见的致病基因[5,6,7]。

本研究通过对一个BOS家系进行高通量测序和Sanger测序，首次检测出中国人群中EYA1基因c.1744delC(p.L592Cfs*47)位点的致病性突变，并对分子病因及遗传学进行了分析。

1、资料与方法

1.1临床资料

研究对象来自中国云南，先证者男，2岁6个月，因“重度听力损失”就诊于我院。采集患儿和家系成员的临床资料，包括家族史、应用氨基糖苷类药物及噪音暴露史、耳鼻喉科体格检查、声导抗、听性脑干反应(ABR)、颞骨CT及头颅MRI,肾脏超声及肾功能结果。该研究符合《赫尔辛基宣言》的伦理原则，经昆明市儿童医院医学伦理委员会批准(No: 2020-01-009-H01),并征得患者及其家属的同意。签署了《基因诊断知情同意书》(患儿由监护人代签)。

1.2方法

1.2.1基因检测方法

抽取2例患者及家系成员静脉血3～5 mL,使用Qiagen DNA Mini Kit试剂盒提取基因组DNA,经S220 Focused-ultrasonicator仪器检验合格。检验过程：将1～3ìg的基因组DNA片段化至150 bp平均大小制备样本DNA文库，在目标区域捕获测序和生物信息分析后得到候选变异位点，从而得到所有可用家族成员的基因组DNA。利用PCR扩增和Sanger测序，将所有经DNBSEQ-T7测序鉴定的突变进行确认。根据美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)指南对变异的基因进行致病性分析进行解读，通过千人基因组、ESP6500、dbSNP、EXAC、内部数据库(Mygenotics)、HGMD,并用REVEL、SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster、GERP++进行变异有害性预测。

1.2.2听力检查方法

所有检查均在本院听力中心标准隔声室完成，本底噪声不大于30 dB(A),符合国家及行业标准。ABR测试刺激声为click(短声),给声刺激重复率为21.1次/s,扫描时间20 ms,滤波100～1 500 Hz,平均叠加1 100次，记录电极放置于前额，接地电极放置于鼻根处，双侧乳突分别为参考电极，每一刺激强度根据需要重复测试，特别是在接近反应阈值处，应重复2次以上进行比较，取刚能分辨出ABR的V波最低刺激声强度作为ABR阈值，单位为dB nHL[8]。

1.2.3影像检查方法

颞骨高分辨率CT(High Resolution Computed Tomograph, HRCT),采取薄层扫描及高分辨率骨算法重建图像的影像学检查技术，了解患儿外、中、内耳的解剖情况。阅片内容主要包括：①内耳：解剖结构是否完整；②耳蜗：大小、圈数、分隔是否正常；③内听道：是否存在扩大或者狭窄的情况；④前庭导水管：是否有扩大；⑤前庭和耳蜗：形态是否正常；⑥半规管和蜗管：是否存在毛玻璃样改变；⑦面神经：位置和形态是否正常。

2、结果

2.1患儿及家系成员的临床表现及特征

本家系共计3代、9人，家系图谱见图1。先证者(Ⅱ-1)自幼年起双耳全聋、言语障碍。体检：双侧耳前瘘管合并双侧鳃裂瘘管，双耳轻度招风耳畸形(图2)。ABR检测：ABR检查(图3)显示95 dB nHL刺激强度下，双耳click-ABR均未诱发出V波。颞骨CT示(图4):双耳耳廓轻度招风耳畸形，右侧乳突小房、乳突窦、鼓室、鼓室窦气化不佳，两侧听骨链形态较大，右侧听骨链位置异常、右侧镫骨缺如可能、右侧前庭窗骨化可能，两侧耳蜗顶转、中转融合成囊腔，两侧水平半规管、前半规管缺如，两侧前庭导水管增宽，左右宽分别约2.6 mm, 3.2 mm,两侧内听道狭窄可能，考虑mondini畸形。

图1 BOS家系图谱

图2先证者(Ⅱ-1)临床表型特征

上方箭头所示为耳前瘘管，下方箭头所示为鳃裂瘘；双侧轻度招风耳畸形。

先证者母亲(Ⅰ-2)自幼听力稍差，随年龄增长听力障碍的情况没有明显改变；体检：双侧耳前瘘管合并双侧鳃裂瘘管；纯音测听检查(图5):右耳气导平均听阈35 dB HL;左耳气导平均听阈38 dB HL;颞骨CT未见明显异常。先证者弟弟(Ⅱ-2)双侧耳前瘘管合并双侧鳃裂瘘管；无听力下降；考虑年龄原因未行颞骨CT检查。该家系中3人出现BOS临床表征，分别是先证者(Ⅱ-1)、母亲(Ⅰ-2)、弟弟(Ⅱ-2)。先证者父亲、外公外婆以及舅舅均听力正常，无耳前瘘与鳃裂瘘管。所有家系成员肾脏超声及血生化检查均未见明显异常。家系成员均无耳毒性药物史及噪声接触史。

2.2高通量测序及Sanger测序校验结果

二代测序检出先证者EYA1基因c.1744delC(p.L592Cfs*47)发生杂合突变，Sanger测序检出先证者的母亲(Ⅰ-2)和弟弟(Ⅱ-2)基因突变位点相同(图6),先证者父亲(Ⅰ-1)在该位点为野生型。家系内符合基因型与表型共分离。

图3先证者(Ⅱ-1) ABR检查

图4先证者(Ⅱ-1)颞骨CT

图5先证者母亲(Ⅰ-2)纯音测听检查

图6 BOS患者家系基因测序结果

为初步探讨本家系致病的分子病因我们对先证者进行了基因全外显子及剪切位点的测序，并对可疑位点进行Sanger验证，最终发现家系所有患者的EYA1基因第18号外显子EYA1c.1744delC(p.L592Cfs*47)杂合突变，导致第592号氨基酸由亮氨酸变异为半胱氨酸，提前出现了终止密码子。致眼缺失同源物1(Eyes absent homolog 1,EYA1)蛋白592位以后的氨基酸序列从L改变CNSARHFDSAQLLCDQGQIQQAPVSHQRRPP ELSNFRLVMRSCQS*(*表示终止密码子),导致592～638位的氨基酸序列发生改变，终止密码子提前出现，造成EYA1蛋白包括EYA结构域(图7)在内的大段截断。根据ACMG指南，该突变被判定为极疑似致病性变异(PVS1+PM2)。在ExAC、ExAC东亚、千人基因组等数据库正常人群中均未检测到该突变，且变异频率为低频变异，符合PVS和PS证据链，因此可初步判断该基因在本家族中的变异为致病性变异。

图7家系中3例患者均发生c.1744delC杂合突变

3、讨论

BOS诊断需要临床诊断和分子诊断相结合。Chang等[9]2004年提出诊断标准，临床表现为鳃裂瘘管或囊肿、听力障碍、耳前瘘管、肾脏畸形；次要临床表现为：外耳畸形、中耳畸形、内耳畸形；其他：不对称面部或味觉异常等。患者必须满足以下3个条件之一的临床表现方可诊断为BOR:主要表现至少3个；具有主要表现2项，并同时有次要表现至少2项；具有主要表现1项，且有至少1个一级亲属中有BOR谱系患者。对于这2种疾病的鉴别，肾脏异常是唯一有帮助的临床特点。如无肾脏结构及功能异常，则可诊断为BOS。听力障碍是一种近乎恒定的临床特征(98.5%)[10],可表现为传导性、感音神经性或混合性，或多或少可能是渐进性的[11],最常见的是混合性听力损失[9],先证者及母亲均有不同程度的听力损失。既往报道中，耳聋、耳前瘘管、鳃裂发育异常成为最常见的3种临床表现，本家系与报道相似[12]。根据上述标准，本家系有3人可临床诊断为BOS。其中先证者及母亲有听力减退、双侧耳前瘘，双侧鳃裂瘘等3项主要表现，先证者还存在外耳、中耳、内耳不同程度畸形，而先证者弟弟无听力减退，临床检查仅见双侧耳前瘘、双侧鳃裂瘘，根据其结合家族史也可诊断为BOS。本家系中所有患者个体肾功能及肾脏B超检测都没有发现异常，所以本家系是典型的BOS家系。

遗传疾病的复杂性致使临床医生需要基因检测来确认临床诊断[13]。在BOS中，诊断性检查通常从直接测序EYA1、SIX1和SIX5基因或包含这些相同基因的多基因panel开始。这种方法可以对近一半的病例进行遗传确认，并降低检测到意义不确定变异的可能性。在本病例中除对数据库进行比较外，通过对致病基因检测，家系中的患者并未发现其他致聋基因变异，故EYA1 c.1744delC(p.L592Cfs*47)突变与患者表型共分离，可确定本突变为本家系表型相关的主要分子基础。

即使在同一家系中，BOS表型异质性较大，如本项研究中患病个体间临床表型各不相同，亦使诊断变得困难。本研究患者携带相同的遗传改变，并证实了相关表型的可变表达性。但是到目前为止，BOR的基因型-表型相关性还未非常明确[14,15]。

EYA1与其他EYA家族成员相似，具有高度保守的C端结构域和蛋白相互作用发散的N-末端反激活结构域，编码271个氨基酸。众所周知，EYA1蛋白不仅作为蛋白磷酸酶发挥作用，而且作为转录共激活因子在胚胎发生中发挥重要作用。EYA1在发育过程中至关重要，是哺乳动物发生变异导致多器官畸形的关键基因[12]。自1997年Abdelha等[16]发现EYA1基因突变是BOR的致病基因之一以来，全球已经发现280多种不同的EYA1基因突变可导致BOS(http: //www.hgmd.cf.ac.uk/,截至2023年10月),而在我国人群中发现30多种不同变异。本研究在中国BOS家系中发现EYA1 c.1744delC(p.L592Cfs*47)新变异，扩展了中国BOS基因谱，可作为EYA1基因在中国人群BOS中新的相关突变。在本病的临床表现中，婴幼儿时期可发现听力下降、耳前瘘、鳃裂瘘等，多数病例中成年后才会发现肾脏病变，若延误诊断或漏诊会导致严重后果[17]。这提示在临床工作中尽早对BOR进行诊断的重要性。

随着分子生物学技术的不断进步，耳聋的基因检测成为疾病诊断的重要手段，但并非所有BOS患者都能检测到基因突变[18]。据报道，BOR或BOS患者携带EYA1基因致病突变为40%,已是最常见突变基因[19]。目前近一半的受影响者未发现致病性变异[20],可能还存在诸多新基因的变异或者目前已发现基因的未知区域，也可能是由于缺乏家族史，而不能被检测出。鉴于本病临床表型变异较大，故在诊断此病时应将临床表现与基因诊断结果相互印证以降低本病漏诊率。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献:

[1]刘梦婷,张天虹.综合征性耳聋的诊断与治疗策略[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2021,35(3):285-288.

[5]温莹莹,孙宇,孔维佳.重视基因诊断在鳃耳肾综合征中的应用[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2018,32(16):1226-1231.

[7]刘梦婷,孟琦,叶祎菁,等.鳃耳综合征家系EYA1基因一个新的无义突变[J].中华耳科学杂志,2020,18(5):922-926.

[8]李果,林垦,王翔,等.婴幼儿听性脑干反应､听性稳态反应､行为测听的相关性分析[J].中国听力语言康复科学杂志,2020,18(4):295-298.

[18]张致恺,张燕梅,宗亚静,等.耳聋相关基因诊断与遗传咨询的临床实践[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2019,33(1):58-62,66.

文章来源:邵华,李勇桦,赵恒,等.EYA1基因变异的综合征家系临床表型和基因分析[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2024,38(07):636-640.