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原发输卵管腺癌中EGFR蛋白表达及EGFR基因突变的研究

2020-12-07 259 上传者：管理员

摘要：目的：研究原发输卵管腺癌中表皮生长因子受体的表达及基因突变情况。方法：选取赣南医学院第一附属医院、赣州市人民医院及赣州市肿瘤医院2010年10月至2019年5月的输卵管石蜡包埋组织86例，其中慢性输卵管炎30例，原发输卵管腺癌56例，以免疫组化法检测EGFR表达情况，以PCR法和双向测序检测EGFR基因19、21外显子序列的突变情况。结果：EGFR在原发输卵管癌中的阳性表达率为82.1%，显著高于慢性输卵管炎的20.0%(P<0.05）。EGFR的表达与原发输卵管癌的组织学分级及有无淋巴转移显著相关（P<0.05），与临床分期无关，在3例原发输卵管腺癌组织提取的DNA中，EGFR19内含子有突变，分别为intron19(2284—96A>G）、intron19(2284—103C>T）以及intron19(2284—148A>T),19、21外显子无突变。结论：EGFR蛋白的阳性表达与原发输卵管癌的组织学分级及淋巴转移有关，与临床分期无关；在原发输卵管癌组中发现EGFR19内含子有突变。

关键词：
原发输卵管腺癌
基因突变
妇科肿瘤
恶性肿瘤
表皮生长因子受体
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原发输卵管腺癌是女性生殖系统恶性肿瘤之一，近年来，输卵管癌发病率有升高趋势。目前针对输卵管癌的早期诊断及治疗尤其是复发性输卵管癌的治疗较棘手，严重威胁妇女的健康和生命，寻找治疗输卵管癌靶向药物的有效靶点为目前输卵管癌研究的重点工作之一。表皮生长因子受体（EGFR）是Ⅰ型跨膜的酪氨酸蛋白激酶受体，是HER-1的表达产物，该基因定位于人第7号染色体的短臂，含28个外显子[1]，是上皮生长因子细胞增殖和信号传导的受体，其介导的信号传导通路参与多种肿瘤的发生、发展，在多种恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用，成为目前肿瘤研究新热点之一[2]。

1、材料与方法

1.1材料

收集赣南医学院第一附属医院、赣州市人民医院及赣州市肿瘤医院2010年10月至2019年5月的输卵管石蜡包埋组织86例，其中慢性输卵管炎30例，原发输卵管腺癌56例，所有患者术前均未接受放化疗，年龄39～75岁，中位年龄56岁；按FIGO分期标准：Ⅰ期10例，Ⅱ期20例，Ⅲ+Ⅳ期26例。使用10%中性甲醛固定样本，石蜡包埋，明确诊断后取少量组织置于-70℃冰箱保存，备DNA提取用。患者知情同意，本研究经医院伦理委员会审核批准。

1.2主要试剂

S-P免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒（中山生物技术开发有限公司）。鼠抗人EGFR单克隆抗体试剂（福州迈新生物技术开发有限公司）。Big-Dye测序试剂盒（ABSCIEX公司）。DNAMarker、PCR试剂盒、DNA产物纯化试剂盒（上海生工生物工程有限公司）。

1.3方法

1.3.1输卵管癌组织EGFR蛋白的表达检测

组织经福尔马林固定、石蜡包埋，切成4μm厚的切片，严格按照S-P检测试剂盒说明书的规定进行免疫组织化学染色，使用PBS代替一抗作阴性对照。阳性评价标准：胞膜、胞浆有EGFR蛋白提示，胞膜或胞浆有棕色颗粒。每张切片选取10个高倍视野，各含目的细胞100个，记录平均阳性率。0分：无着色细胞；1分：着色细胞数≤10%;2分：10%<着色细胞数≤50%;3分：50%<着色细胞数≤75%;4分：着色细胞数>75%。对染色强度进行记录。0分：无着色；1分：淡黄色；2分：棕黄色；3分：棕褐色。根据染色细胞百分率及染色强度二者乘积做最后得分，0～3分：（-），4～5分：（+），6～7分：（++），>8分：（+++）。

1.3.2输卵管癌组织中EGFR基因19、21外显子序列的检测

1.3.2.1EGFR基因19、21外显子的扩增

用酚氯仿法提取DNA，纯化后用2%琼脂糖凝胶电泳以确定提取的DNA质量；应用GeneBank得出EGFR全序列。使用WebPrimer:DNAandPurposeEntry针对第19和21外显子设计引物，见表1。

表1外显子上、下游引物设计

PCR反应体系为25μL，反应条件：95℃热启动11min,94℃变性1min,56℃（19外显子）/60℃（21外显子）退火45s,72℃延伸1min,35个循环，72℃延伸10min。用琼脂糖凝胶电泳检测后进行纯化，具体操作按照说明书。

1.3.2.2测序

将EGFR基因19、21外显子纯化后扩增产物进行测序前热循环，PCR产物5μL，测序引物2μL，染料（BIGDYE)2μL,DDH2O1μL；热循环条件：95℃预变性3min,95℃变性10s,50℃退火10s,60℃延伸50s,35个循环后4℃保存。按照说明书规定再次纯化热循环产物，然后通过DNAStar、Seguencescanner对比所测序列和GenBank发表序列，观察突变。

1.4观察指标

分析EGFR蛋白在输卵管组织中的表达，EGFR蛋白的表达强度与输卵管癌临床及病理的关系，EGFR基因在输卵管癌中的突变。

1.5统计学方法

采用SPSS24.0统计学软件进行X2检验、Spearman分析检验或Fisher确切概率分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1EGFR蛋白在输卵管组织中的表达

免疫组织化学结果显示，在86例输卵管石蜡标本中，EGFR阳性表达率在输卵管炎及原发输卵管腺癌组织中分别为20.0%(6/30）和82.1%(46/56），差异有统计学意义（P<0.05），见表2，图1。

表2EGFR在输卵管组织中的表达

图1EGFR蛋白在输卵管癌组织中的表达

2.2EGFR蛋白的表达强度与输卵管癌临床及病理的关系

EGFR在原发输卵管腺癌中的表达与组织学分级及淋巴转移有关，随着组织学分级的降低，EGFR阳性表达率逐渐增高（P<0.05），有淋巴转移者，EGFR阳性表达率显著增加（P<0.05);EGFR阳性表达率与FIGO分期无关，见表3。

表3EGFR蛋白表达强度与原发输卵管腺癌临床病理的关系

2.3EGFR基因在输卵管癌中的突变

数据表明，有3例检测到19内含子点突变，分别为intron19(2284—96A>G）、intron19(2284—103C>T）以及intron19(2284—148A>T），未见EGFR第19、21外显子突变，见图2。

图2EGFR基因突变的测序结果

3、讨论

流行病学调查研究显示，输卵管癌每年的平均发病率约为3.6/1000000[3]，且LiaoCI等[4]回顾研究，比较2001年至2005年、2006年至2010年、2011年至2014年美国输卵管癌的年平均发病率分别为19%、35%、63%，可见输卵管癌的发病率呈明显上升趋势，且卵巢癌及腹膜癌的发生起源与输卵管有关，肉眼和镜下难以区分输卵管肿瘤与卵巢肿瘤，有一定误诊率，实际上原发性输卵管癌的发病率可能更高，而输卵管癌早期多无症状，容易被忽视和误诊，复发的输卵管治疗非常棘手，寻找治疗输卵管癌靶向药物的有效靶点为目前输卵管癌研究的重点工作之一。表皮生长因子受体（EGFR）与多种肿瘤的发生、发展相关[5,6]，可促进癌细胞增殖、转移等[7,8]。ChungTK等[9]研究报告18例原发性输卵管腺癌中，16例EGFR高表达，表达率为89%，在输卵管腺癌中EGFR过度表达表明EGFR基因可能在其肿瘤发生中起作用。而NataliaHyriavenko等[10]及Alvarado-CabreroI等[11]研究显示，EGFR在其研究的输卵管癌组织中，阴性表达率却偏高，这可能与所研究的人种或者其他因素有关，在本研究中，利用免疫组化的方法检测56例不同临床分期、分化程度各异的输卵管腺癌中EGFR蛋白的表达，发现EGFR蛋白在输卵管炎及输卵管癌组织中阳性表达率分别为20.0%、82.1%，呈增高趋势；进一步统计学分析表明EGFR蛋白表达与输卵管腺癌密切相关，在输卵管腺癌组织中的阳性表达率及表达强度与组织学分级及淋巴转移有关，与临床分期无关，表明EGFR蛋白表达与输卵管发生发展密切相关。

随着全球气候的改变，肿瘤发生及检出率上升，而患者对治疗效果的期望及生存期望只增不减，以往的治疗方式远远满足不了患者的身体及心理需求，对不良反应小、效果好的治疗方式或药物的需求越来越大，靶向治疗就是其中之一，而随着肿瘤靶向治疗的研究进展，多种恶性肿瘤的初次及复发治疗疗效越来越好，患者的生存质量提高，生存期延长，这其中，研究主要是针对非小细胞肺癌，在肺腺癌的靶向治疗研究中，酪氨酸激酶抑制剂治疗敏感人群中多数有EG-FR酪氨酸激酶编码区（EGFR-TK）基因突变，其基因突变主要位于18-21外显子，其中90%位于19号及21号外显子[12]。多项研究报道，EGFR靶向药物对多种肿瘤体内及体外试验的研究治疗均有效，如卵巢癌、子宫内膜癌，其中日本学者Takahash等[13]研究显示西托昔单克隆抗体可有效治疗子宫内膜癌，延长小鼠生存期。张雷英等[14]研究显示子宫内膜癌的EGFR19外显子存在基因突变，有望成为EGFR靶向药物治疗的靶点。对输卵管癌的靶向治疗研究甚少，KonstantinopoulosPA等[15]研究输卵管癌的靶向治疗中显示卡博替尼对输卵管癌患者的治疗效果不佳，当然不能否认其他靶点的靶向药物疗效，因此，寻找输卵管癌有效靶向药物治疗靶点的研究至关重要。在本研究中，有3例检测到19内含子点突变，分别为intron19(2284—96A>G）、intron19(2284—103C>T）以及intron19(2284—148A>T），同时此3例突变组织的EGFR蛋白强度+++，提示EGFR基因突变与其蛋白表达强度可能有关。

参考文献：

[1]苏丹,李佩玲.人表皮生长因子受体2蛋白及间皮素在卵巢癌免疫靶向治疗中的应用研究进展[J].中国妇幼保健,2019,34(1):233-235.

[2]王雪,蒙臣,曾文,等.表皮生长因子受体信号通路影响紧密连接的作用与机制研究进展[J].中国医药导报,2020,17(15):37-40.

[5]杨炳能.靶向人表皮生长因子受体3单克隆抗体抗肿瘤的研究进展[J].国际生物制品学杂志,2019,42(6):289-293.

[6]翟美萍.曲妥珠单抗对人表皮生长因子受体阳性胃癌患者的临床疗效及对血清肿瘤标志物的影响分析[J].当代医学,2019,25(4):135-136.

[8]王朝翔,王震宇,倪兰春.分子靶向药物治疗脑胶质瘤的研究[J].当代医学,2019,25(22):190-192.

张雷英,王洋,肖秋香,谢晓英.原发输卵管腺癌中EGFR蛋白表达及EGFR基因突变的研究[J].当代医学,2020,26(34):1-4.