首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 特种医学论文 > 法医学论文 > HPLC-MS/MS法检测全血中骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱成分

HPLC-MS/MS法检测全血中骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱成分

2025-01-23 33 上传者：管理员

摘要：本文旨在建立一种人体血液中骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱的高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）的检测方法。采用乙腈沉淀蛋白法作为前处理方法，过膜后经Aglient SB-C18（100 mm×2.1 mm×1.8μm）色谱柱分离，含0.1%（体积分数）甲酸水-乙腈作为流动相，以0.4 mL/min的流速进行梯度洗脱，外标法定量。质谱采用电喷雾正离子（ESI+）模式、多反应监测（MRM）模式检测。结果显示，该方法检测血液中骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱成分在10～1 000 ng/mL范围内线性关系良好（R2>0.999），检出限和定量限分别为3 ng/mL和10 ng/mL。在10、100、500 ng/mL三种浓度水平，骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱的提取回收率分别为96.2%、95.3%、97.0%和87.9%、84.9%、92.9%，不同个体血液的基质效应均不超过±25%，日内准确度和日间精密度（n=6）在3.6%～9.8%和7.3%～12.8%范围内，准确度在2.4%～9.5%范围内。该方法前处理简单，灵敏度高，能充分满足法庭科学对血液中骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱成分的检测工作要求。

关键词：
全血
去氢骆驼蓬碱
毒物分析
骆驼蓬碱
高效液相色谱-串联质谱
加入收藏

骆驼蓬碱（harmaline）和去氢骆驼蓬碱（harmine）（分子结构如图1所示）属于三环 β-咔啉类活性生物碱，可以从蒺藜科骆驼蓬属多年生草本植物骆驼蓬的种子和全草中提取得到[1]。骆驼蓬广泛分布于我国西北部干旱地区[2]，在我国维吾尔族、蒙古族、藏族等少数民族和巴基斯坦民间的传统医药中均有应用，性凉，有毒。适当使用具有清热镇痛、止咳平喘、消炎抗菌、催产堕胎等效用[3-4]，使用不当则会对人体造成伤害。我国近年也出现了骆驼蓬植物使用不当导致死亡的案件。骆驼蓬全草和种子中主要生物碱成分为骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱[5]，其普遍毒理症状为心肌减弱引起的血压降低。中等剂量下会引起震颤和阵挛性抽搐，但不会增加脊髓反射兴奋性。致命剂量下会对中枢神经系统造成显著抑制作用进而引起运动麻痹、抽搐、呼吸瘫痪、体温下降、心脏骤停等[6]。本文建立了一种血液中骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的高效液相色谱-串联质谱检测方法（highperformance liquid chromatography-tandem massspectrometry，HPLC- MS/MS），结合实际案例，证明该方法快速、灵敏、实用、可靠，可应用于法庭科学中骆驼蓬植物滥用类案件的检测工作。(a) (b)

图1分子结构图

1、材料与方法

1.1仪器与试剂

AB SCIEX 5500+ QTRAP高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪；BRANSON 1210超声波清洗机（EMERSON公司，美国）；3-18K型高速冷冻离心机（Sigma公司，德国）。骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱（均为HPLC级，上海源叶生物）；甲醇、乙腈、甲酸（均为HPLC级，美国Fisher Chemical公司）；试剂水由Milli-Q IQ7003超纯水系统（德国Merck KGaA公司）制取。

1.2标准储备液的配制

精确量取适量骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱标准品溶液，用甲醇配制成0.1 mg/mL混合标准溶液，密封，-18℃保存；实验中根据检测需求，用甲醇对该混合标准品溶液进行系列浓度稀释。

1.3样品前处理

取0.2 mL血液于离心管中，加入0.8 mL乙腈，超声处理10 min，以10 000 r/min高速离心10 min，取上清液经0.22μm有机滤膜过滤后，用超纯水1∶1等体积稀释（或稀释至线性范围内）备检。

1.4 HPLC-MS分析条件

1.4.1液相色谱条件

色谱柱：Aglient SB-C18（100 mm×2.1 mm×1.8μm）；柱温40℃；进样量1μL；流速0.4 mL/min；流动相A为0.1%（体积分数）甲酸水溶液；流动相B为乙腈[7-8]，具体流动相梯度洗脱程序如表1所示。

1.4.2质谱条件

电喷雾离子源，正离子模式（ESI+）；多反应监测扫描模式（MRM）；电喷雾电压：5 500 V；源温度：500℃，气帘气（CUR）：40 psi、碰撞气（CAD）：10 psi、雾化气（GS1）：55 psi、加热气（GS2）：55 psi，均为高纯氮气。骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱质谱参数见表2。

表1 HPLC梯度洗脱程序

1.5计算和表述提取回收率和基质效应计算公式如下：提取回收率=B/A×100%基质效应=（A/C-1）×100%，式中：A为空白血液按照1.3方式处理，测得峰面积；C为相应浓度的骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱标准溶液所测峰面积。精密度为样品测定值的标准偏差与平均值的比值，准确度为测定平均值与参考值的差值与参考值的百分比[9-10]。

2、结果与讨论

2.1质谱条件优化

在ESI+模式下，分别使用骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱1 µg/mL的单标溶液，通过直接进样泵以10 µL/min流速进入质谱，确定母离子、子离子，并对去簇电压、碰撞能量进行优化。优化后骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的质谱参数如表2所示，该MRM条件下可能的裂解情况[11]如图2所示，离子对色谱图如图3所示。

表2多反应监测模式下骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱质谱参数的优化

图3空白血液总离子流图

（a）和500 ng/mL骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱血液添加样品的总离子流图

（b）及提取离子流色谱图（c）

2.2线性范围、检出限和定量限

将适量骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱混合标准工作溶液分别添加至空白血液中，得到3、5、10、25、50、250、500、1 000 ng/mL系列浓度的加标血液样品溶液，按照1.3节方法进行前处理。在1.4 HPLCMS分析条件下，以定量离子峰面积对目标物浓度进行线性回归，绘制工作曲线。结果显示，在10～1 000 ng/mL浓度范围内，骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱的线性回归方程R2均大于0.999，满足定量分析要求。检出限和定量限分别按照3倍信噪比（S/N≥3）和10倍信噪比（S/N≥10）确定。骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱回归方程、R2、检出限、定量限如表3所示。

2.3方法学评价

2.3.1基质效应分析

为评估前处理方法血液样本中生物基质对目标物测定值的影响，取5份不同来源的空白血液，按照1.3节方法进行前处理，得到5份空白血液基质（分别以A、B、C、D、E进行编号），并分别对5份空白血液基质进行目标物添加，得到10、100、500 ng/mL三种浓度的加标基质样本。在1.4节HPLC-MS分析条件下，对空白基质、空白水溶液、加标基质样本和相应浓度的标准溶液进行检测（加标基质样本和标准溶液平行检测6次，空白超纯水溶液紧随加标基质样本后进行检测），按照1.5节公式，以定量离子峰面积计算得到基质效应数值及相对标准偏差，结果见表4，空白血液基质及空白超纯水溶液的提取离子对色谱图见图4。如图4所示，加标基质样本和标准溶液中骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱的保留时间一致且稳定；血液基质在保留时间3～7 min的响应值普遍一致，略高于超纯水，且均未提取出目标物离子对，表明该方法下人体血液基质对目标物定性结果无干扰。如表4所示，在10、100、500 ng/mL三种浓度条件下，5份血液样本对骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱的基质效应计算值均未超出 ±25%，相对标准偏差（RDS）均未超出15%[9]，表明本文方法条件下人体血液基质对骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的检测结果影响较小，基质效应不明显。

2.3.2回收率和重现性分析

将骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱混合标准工作溶液添加至空白血液E中，得到10、100、500 ng/mL三种浓度的加标血液样品溶液，按照1.3节方法进行前处理。在1.4 HPLC-MS分析条件下，对骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱含量进行检测，按照1.5节公式计算得到准确度和日内精密度、日间精密度，结果见表5。如表5所示，低、中、高三种浓度的血液添加样本中，骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱的提取回收率分别为96.2%、95.3%、97.0%和87.9%、84.9%、92.9%，表明本文采用的前处理方法对血液样本中骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱的提取损失较小。同时，日内精密度和日间精密度（n=6）分布在3.6%～9.8%和7.3%～12.8%范围内，准确度分布在2.4%～9.5%范围内，重现性良好，表明本实验方法稳定可靠。

表3血液中添加骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱的回归方程、R2、检出限、定量限

表4不同人体血液对骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱的基质效应及相对标准偏差

图4空白血液基质（编号A、B、C、D、E）、超纯水和加标基质样本的提取离子流色谱图

表5血液中添加骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱实验测定的回收率、精密度（n=6）和准确度

2.4案例应用与讨论

2022年，某地发生一起非正常死亡案件，死者血液样本按照本文方法进行处理及检测，成功检出骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱成分，含量分别为1.2μg/mL和0.2μg/mL，检测结果为案件的后续侦查提供了可靠的技术支持。

3、结论

本文采用乙腈沉淀蛋白法作为人体血液样品的前处理方法，建立了血液中骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱成分的HPLC-MS/MS分析方法。该方法前处理简单，灵敏度高，能满足法庭科学对血液中骆驼蓬碱、2024年第49卷第6期管旭,等：HPLC-MS/MS法检测全血中骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱成分 ·579·去氢骆驼蓬碱成分的检测工作需求。

参考文献:

[2中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(第43卷)[M].北京:科学出版社,1997: 123.

[3]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·维吾尔药分册[S].乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社,1998: 80-81.

[4]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草·维吾尔药卷[M].上海:上海科学技术出版社,1999: 297-299.

基金资助:广州市民生科技攻关专题(2019030009);

文章来源:管旭,朱焕慧,彭聪,等.HPLC-MS/MS法检测全血中骆驼蓬碱､去氢骆驼蓬碱成分[J].刑事技术,2024,49(06):574-579.