肺癌发病率及死亡率极高，其中最常见的组织学类型为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),约占80%～85%[1]。随着分子医学的发展，肺癌治疗逐渐由传统的放化疗向特异性高、副作用小的靶向药物治疗转变，尤其是酪氨酸激酶抑制剂(TKI)靶向药物的应用使肺癌治疗进入一个新时代[1-2]。早期研究认为，EGFR与ALK驱动基因突变是互斥的[3],但是近年来不断有二者共突变病例报道[4-10]。对于双突变患者临床病理特征、治疗策略及预后等尚无统一的标准与规范。本文收集双突变患者8例，旨在分析其临床病理特征、发病率及临床用药情况等，为双突变患者积累临床数据资料，为研究此类患者的发病机理及制定优化的治疗策略提供参考。

1、资料与方法

1.1 临床资料

回顾分析2016年至2021年我院经活检或手术切除后确诊的NSCLC患者2 028例，收集整理临床病理资料，包括性别、年龄、临床分期、病理组织学类型等。病理诊断由两名高年资病理医师阅片并复核，并按照临床分期参照AJCC第八版TNM分期系统[1]。通过预留电话随访，生存时间为确诊日到死亡日或随访截止日(2023年12月01日)。本研究经陕西省肿瘤医院伦理委员会审批(批准号：医伦审【2022】第128号)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化

标本均经10%中性福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，4 μm厚切片，HE染色。ALK(D5F3)兔单克隆抗体购自罗氏诊断产品有限公司，采用VENTANA BenchMark XT全自动免疫组化仪染色，同时设置阴性及阳性对照。阳性判定：肿瘤细胞胞质呈强的颗粒状棕黄色。

1.2.2 PCR检测

经HE染色，评估肿瘤细胞百分比及肿瘤细胞数量，再切取4～6 μm厚5～10张，按照厦门艾德ADx-人类EGFR等10基因突变联合检测试剂盒提取FFPE DNA/RNA kit, 用A260/A280评估纯度，按说明进行操作，经Stratagena Mx 3000P荧光定量PCR仪分析，然后判读。

1.2.3 二代测序(next generation sequencing, NGS)

通过活检或手术切除获得FFPE样本，选取肿瘤细胞含量≥20%的标本进行实验。分别使用QIAamp DNA FFPE Tissue kit和DNAeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen, USA)提取FFPE切片和全血对照样本的基因组DNA。利用世和一号425基因(Geneseeq)的定制化xGen探针(Integrated DNA Technologies)进行杂交富集；使用Dynabeads M-270(Life Technologies)、xGen Lockdown hybridization和wash kit(Integrated DNA Technologies)进行捕获反应；用KAPA HiFi HotStart ReadyMix(KAPA Biosystems)中Illumina p5(5'AATGATACGGCGACCGA3')和p7引物(5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT3')进行聚合酶链反应(PCR),获得捕获的文库，然后用Agencourt AMPure XP beads进行纯化；文库用qPCR进行定量，使用the KAPA Library Quantification kit(KAPA Biosystems),Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)测定大小，在HiSeq4000 NGS平台(Illumina)上对目标富集文库进行测序。对照组的平均覆盖深度为100X,肿瘤组织的平均覆盖深度为1 200X。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism8.0软件进行分析，组间差异采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 EGFR突变患者临床病理特点

2 028例NSCLC中，EGFR突变患者664例，突变率为32.74%(664/2 028),EGFR突变集中在18、19、20、21号外显子，其中大多数突变为L858R和19del(分别占38%和47%),少见突变位点有20ins、S768I、L861Q、T790M、G719X等，尚有少数为2种突变。EGFR突变与患者年龄、性别、病理类型有关，差异有统计学意义(P<0.05),与临床分期无关，差异无统计学意义(P>0.05),见图1和表1。

图1 EGFR突变类型

表1 EGFR突变与NSCLC临床病理特征的关系n(%)

2.2 ALK融合患者临床病理特点

2 028例NSCLC中，ALK融合患者95例，阳性率为4.68%(95/2 028),ALK融合与患者年龄、性别、病理类型有关，差异有统计学意义(P<0.05),与临床分期无关(P>0.05),见表2。

表2 ALK融合与NSCLC临床病理特征的关系n(%)

2.3 EGFR/ALK共突变患者临床病理特点

EGFR/ALK共突变患 者8例，突变率 为0.39%(8/2 028)。女性7例，男性1例，年龄35～69岁，平均年龄56岁；均为肺腺癌，且以实体型为主，部分伴有细胞内黏液(见图2);吸烟1例，非吸烟7例；临床分期Ⅱ期1例、Ⅲ期1例、Ⅳ期6例；手术切除标本2例、穿刺活检标本6例，1例同时性多原发肺癌(病例7);病例2～8均在不同时期采用TKIs药物治疗，其中接受EGFR-TKIs治疗者3例(病例2、3、5),疾病进展(progressive disease, PD);接受ALK-TKIs治疗者2例(病例6、8),均部分缓解(partial response, PR);同时使用EGFR及ALK双靶向治疗1例(病例7),PD;先使用EGFR后ALK-TKIs治疗者1例(病例4),PR;生存时间5～81个月，其中3例尚存活，见表3。

图2低分化腺癌/实体型且富于细胞内黏液(HE×400)

2.4 8例共突变患者IHC、PCR及NGS结果

IHC ALK Ventana-D5F3 8例均为阳性表达(见图3),PCR检测EGFR突变与ALK融合共存(见图4),其中EGFR基 因突变5例19del(62.5%)、2例21 L858R突变(25%)、 1例20 S768I突变 (12.5%),突变类型L858R和19del占85%以上，8例均ALK融合；经NGS测序4例(见表4),结果显示2例结果与ARMS法结果一致，余2例仅检出ALK融合，4例均伴有EML4-ALK融合，其中3例E13:A20、1例E6:A20,部分病例尚伴有罕见融合类型及点突变。另外，对结果不一致的病例再行荧光PCR法检测，仍显示双突变。

3、讨论

NSCLC患者进行驱动基因检测是精准靶向药物治疗的基础，EGFR和ALK是肺癌常见的两个驱动基因。EGFR是一种酪氨酸激酶受体，参与细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等一系列过程。EGFR突变在女性、不吸烟、肺腺癌及亚裔人群中的发生率较高[11-12],且其突变主要发生在编码酪氨酸激酶区的第18～21号外显子，有药物敏感及耐药突变，其中最常见的药物敏感突变是外显子19缺失(19del)和外显子21点突变(L858R)[1,11-13]。本研究数据显示EGFR突变与患者年龄、性别及组织学类型相关，且19del与L858R突变占85%以上，与以往研究报道较一致。

表3 8例EGFR/ALK双突变患者临床病理特征

图3肿瘤细胞ALK-D5F3细胞质阳性表达(IHC×400)

图4PCR双突变扩增曲线

表4 PCR与NGS测序结果比较

ALK基因位于人类第2号染色体的p23带，编码ALK受体酪氨酸激酶，伴有ALK融合的肺癌是NSCLC一个重要的临床亚型，其发生率为2%～10%[11-14]。本实验中ALK突变率为4.68%,与文献报道相吻合。研究显示，ALK基因融合更常见于年轻、富含胞内黏液的实体型腺癌中[13-15],本文ALK突变在低分化腺癌中占有优势，在≤60岁的患者中阳性率57.89%,>60岁患者阳性率42.11%,提示更多见于年龄较小者，这与文献报道较一致。

早期研究认为肺癌驱动基因的突变是互斥的[3],后来发现共突变病例的存在，一项大宗研究[16]报道，共同出现的常见 的基因突变是EGFR与 TP53(28.26%)、 ERBB2(3.66%)、 PIK3CA(3.14%)、ROS1(2.38%)和KRAS(28.26%)。EGFR与ALK共突变是非常罕见的。近年来随着分子检测深度及灵敏度的提高，EGFR/ALK双突变小样本研究及个案报道不断出现[4-10],但由于样本量少，各研究间报道的突变率不尽相同。ZHAO等[4]人在5 816例NSCLC中筛选出26例共突变患者，占比0.45%,是目前病例数较多的报道。吴丹等[6]在508例NSCLC 中筛选出7例共突变肺 癌，占比1.38%。王鑫等[5]对近年双突变肺癌做了综述总结，报道其突变率约为1%(0.3%～1.3%)。我中心发现EGFR/ALK共突变患者8例，突变率为0.39%(8/2 028),与文献报道接近。分子遗传学分析显示，双基因突变共存的现象可能与非小细胞肺癌高异质性有关。这可能是由于克隆异质性或药物抵抗性的存活机制造成的，空间转录组信息可能会提供更多的线索。

既往研究表明[5,7,9-10],双突变肺癌多见于女性、不吸烟、晚期肺腺癌。本实验中有7例均为非吸烟女性患者，且以IV期为主，与以往研究结果基本一致。晚期肺癌患者中双突变率高，可能是疾病进展过程中基因改变不断积累，负荷不断增加的结果。在肺腺癌亚型上，尚有研究表明，ALK重排阳性常发生于具有筛状结构或实体型腺癌，尤其是富含胞内黏液的实体型腺癌[13,15],有趣的是本组双突变病例中有5例(5/8)均以实体型腺癌为主，部分尚伴有胞内黏液，提示双突变肺癌患者腺癌亚型上，可能与ALK阳性患者更接近。因此，在临床实践中要特别留意此种类型。

另外，经ARMS-PCR检测，本研究8例双 突变病例中，EGFR基因突变 5例19del (62.5%)、2例21 L858R突变 (25%)、1例 20 S768I突变(12.5%),突变类型L858R和19del占85%以上，与EGFR单独突变类型相似，说明双突变患者以常见药物敏感突变为主。选取评估合格的4例患者DNA进行NGS测序，其中病例4和7与ARMS-RCR结果一致，即同时检测到EGFR突变与ALK基因融合。但病例2和8测序并未发现EGFR突变，分析其原因可能为肿瘤组织中存在EGFR突变的瘤细胞少，突变丰度低，Ct值也高，接近临界值。另外，经实验对比发现[17],ARMS-PCR技术对EGFR基因已知位点突变总检出率与 NGS 接近，但对某些单个已知突变位点检出率与 NGS相比可能略高，ARMS法灵敏度更高(0.1%～0.001%)[18],不一致的2例正好也说明了这一点。且ARMS-PCR实验时间短，操作方便，费用相对低，易于推广。所以若临床所需检测的突变都在已知范围内，可选择此技术对其进行位点检测，以指导患者用药。

ALK基因易位导致ALK融合基因的表达，可在多个分子水平上进行检测，包括ALK Ventana-D5F3 IHC、FISH、RT-PCR、NGS等[13]。4个平台均具有较高的灵敏度及特异度，且具有较高一致性，但不同平台检测各有优缺。ALK Ventana D5F3 IHC由于其操作简单且快速经济，被美国FDA批准作为选择克唑替尼治疗的伴随诊断。RT-PCR只能检测已知ALK融合基因类型，对罕见融合检测有缺陷。NGS除了点突变，也可以检测基因易位，同时可以和其他基因如EGFR、K-RAS、C-MET等多个基因一起检测，但其流程繁琐，影响因素较多，且对肿瘤细胞含量及占比都有严格要求，所以亦有局限性。在目前发现的20多种EML4-ALK融合变体亚型中最多见的是EML4的变体1[v1:外显子13与ALK的外显子20融合(E13;A20)]和变体 3v3a/b[外显子6a/b与ALK 的外显子20融合(E6a/b; A20)][13]。在我们研究的病例中，8例IHC蛋白水平ALK阳性表达，经PCR检测均发现ALK融合，一致率100%。经病理医生评估选择合格标本4例，进行了基于DNA-base的NGS测序，结果显示，ALK均伴有融合，其中E13;A20融合3例，E6;A20融合1例，均为常见融合位点。另外测序结果显示部分病例同时伴有其他少见/罕见基因融合或点突变，这些少见/罕见融合位点或点突变的功能及临床意义需要进一步扩大样本研究。

与传统的化疗相比，发生EGFR或ALK驱动基因突变的肺癌患者可以从靶向药物治疗中获益更多，美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)推荐表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)作为EGFR突变晚期非小细胞肺癌患者的一线治疗。对于EGFR阳性的患者可选择EGFR-TKI治疗，包括吉非替尼、厄罗替尼、埃克替尼或阿法替尼等，ALK或ROS1融合基因阳性的非小细胞肺癌患者，可选择克唑替尼。但是双突变肺癌治疗策略尚无统一的标准与指南，已报道的关于EGFR及ALK双突变肺癌中，选用EGFR或ALK-TKIs单靶或双靶、还是先后序贯以及对三代TKI克唑替尼的疗效等都不尽相同[4-5,7-9,19-21]。我们的病例中有7例患者在治疗不同时期采用了TKIs药物治疗，其中接受EGFR-TKIs治疗者3例(病例2、3、5),PD;接受ALK-TKIs治疗者2例 (病例6、8),均PR; 同时使用EGFR及ALK双靶向治疗1例(病例7),PD;先使用EGFR后ALK-TKIs治疗者1例(病例4),PR;另外，尚存活的3例患者，均于不同时期服用ALK-TKIs(2例口服阿来替尼，1例先用阿美替尼后用恩沙替尼)。可以看出使用ALK-TKIs者似乎疗效更佳。另外，对比治疗疗效与Ct值结果发现，双突变病例中ALK检测Ct值更小，是否可将其作为双突变用药参考指标指导临床。因此，在临床工作中需加强多学科协作，在没有标准治疗指南的情况下，可以和临床医生充分沟通检测情况，建议应用ALK-TKI治疗，使患者获益。

另外，测序结果显示有3例(病例4、7、8)同时伴有罕见位点融合/突变，且均与ALK基因相关，经分析发现病例4和8均采用二代ALK-TKI取得了较好疗效，获得了较长生存时间。这对于伴有罕见类型突变的患者用药选择具有参考意义。此外，病例8是一名35岁患者，此例患者首次就诊时已多发转移，经阿来替尼治疗后目前总生存已达到81个多月，疗效可观。作为青年肺癌这个特殊群体，常由于发病隐匿，且认识和警惕性差，而导致漏诊及误诊，延误治疗[22],而此例患者能够达到如此好的治疗效果是否与其同时伴有ALK点突变及高的突变丰度(34.84%)有关，有待进一步研究证实。针对青年型肺腺癌，孙卓琛[22]等人做过综述总结，发现青年肺腺癌患者基因突变类型与老年患者具有差异，虽然仍以常见的基因突变表型为主，但可能存在其余更为显著的罕见基因突变。表明老年与青年肺癌患者肿瘤发生机制可能不同，所以在今后的工作中需特别关注此类病例，加强此方面的研究。

由于高分辨率胸部CT 和肺癌早期筛查的普及，同时性多原发肺癌的检出率提高，鉴别多原发肺癌与肺癌肺内转移成为关注的临床问题。因为这影响着临床分期、预后评估及治疗选择。病灶发生不同部位、不同组织学类型、不同的基因变异特点，对于多原发肺癌诊断具有较好的提示意义[23]。本组实验中病例7,双肺多发结节，在组织学类型上，右肺中叶为乳头状腺癌，右肺下叶为腺泡状腺癌，经基因检测右肺中叶ALK融合，右肺下叶L858R突变，中叶下叶之间基因变异类型存在差异，推测属于同时性多原发肺腺癌。由于肿瘤异质性原因，同一个体内的多个病灶间可能会有截然不同的克隆性特征。且研究表明[24],在多灶性肺癌中，双突变率更高。所以伴有多结节的肺癌患者，有条件的情况下应该对每个单独病灶分别进行病理学检查及分子检测。

综上，双突变肺癌发病率低，多见于女性、非吸烟腺癌患者中，双突变主要为常见药物敏感突变类型，对ALK-TKIs药物治疗疗效更佳。因此，在治疗初期对肺癌患者可以通过多平台多方法进行多驱动基因联合检测，提高分子突变检出率以获得更多的基因突变信息，更精准的指导用药治疗。

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基金资助:陕西省自然科学基础研究计划(编号:2019JM-538);

文章来源:赵喜连,丁彩霞,俞雪燕,等.EGFR突变与ALK融合共存非小细胞肺癌的临床病理特征分析[J].现代肿瘤医学,2024,32(24):4616-4623.