肺癌是我国常见的恶性肿瘤[1],且多数为非小细胞肺癌( non⁃small cell lung cancer, NSCLC)｡ 奥希替尼为表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor, EGFR) T790M 突变阳性 NSCLC患者的一线用药方案[2],但临床疗效却不尽相同,且最终都会发展为耐药,使肺癌 5 年总生存率仍 < 20% ,所以深入探究影响肺癌治疗效果的分子标志物具有重要意义｡ 长 链 非 编 码 RNA ( long non⁃coding RNA, ncRNA)具有较高的组织特异性､敏感性和可靠的稳定性,可作为肿瘤治疗靶点,其表达失调与多种肿瘤的发生发展以及耐药有关[3⁃5],但与 NSCLC 的关系尚不清楚｡ 本研究基于生物信息学的提示,探讨LINC01140 过表达对肺腺癌细胞 H1975 增殖､迁移及侵袭的影响,旨在为 NSCLC 患者的治疗和预后评估提供候选分子标志物,以提高治疗效果,改善预后｡ 本研究经河北省人民医院医学伦理委员会审核通过[2021 科研伦审第(147)号]｡

1、材料与方法

1. 1 数据库中 LINC01140 表达应用 

GEPIA 网站分析数据库收录肺癌组织及癌旁组织样本中 LINC01140的表达情况;UALCAN数据 库 分 析 其 与 临 床 特 征 的 关 系; Kaplan⁃MeierPlotter 数据库分析其与生存的关系｡

1. 2 材料与试剂

人支气管黏膜上皮细胞 HBE､人肺腺癌细胞H1975 均购自中国科学院上海细胞库｡ 胎牛血清及RPMI 1640 培养基购于美国 Gibco 公司｡ pcDNA3. 1⁃LINC01140 及 阴 性 对 照 ( pcDNA3. 1⁃negativecontrol, pcDNA3. 1⁃NC)质粒购自美国 Santa Cruz 公司｡ TRIzol 试剂购自美国 Invitrogen 公司｡ 转染试剂､逆转录试剂盒､MTS 增殖检测试剂盒均购自美国 Promega 公司｡ Transwell 小室购自美国 Corning公司｡ Matrigel 基质胶购自美国 BD 公司｡ 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成｡ 酶标仪及二氧化碳培养箱购自美国 Thermo公司,倒置显微镜购自日本 Olympus 公司,电泳槽购自北京市六一仪器厂等｡

1. 3 细胞培养与质粒转染

人支气管黏膜上皮细胞 HBE､人肺腺癌细胞H1975 分别在含 10% 胎牛血清的完全 1640培养基中复苏,置于无菌培养箱(37 ℃ ､5% 二氧化碳)培养｡ 选取处于对数生长期的 H1975细胞,胰酶消化后接种于 6孔板(3 × 105个/ 孔) 中,待细胞融合 70% ~ 80%时, 分 别 将 pcDNA3. 1⁃NC､pcDNA3. 1⁃LINC01140 质粒转染到 H1975 细胞中｡设 为 对 照 组 ( H1975 / NC )､ 高 表 达 组 ( H1975 /LINC01140)｡

1. 4 RT⁃PCR 法检测

细胞系中 LINC01140的表达TRIzol 试剂盒提取细胞总 RNA,逆转录试剂盒将 RNA 逆转录成 cDNA,检测 LINC01140 的表达水平｡ 反应条件:95 ℃ 预变性 3 min,95 ℃ 变性 30 s､60 ℃退火 30 s､72 ℃延伸 30s,共 30个循环;72 ℃延伸 5 min, 4 ℃ 保 存｡ 采 用 2- ΔΔCt 法 计 算LINC01140 mRNA 的相对表达量｡

1. 5 MTS 检测

细胞增殖将处于对数生长 期 的 H1975 / NC 和 H1975 /LINC01140细胞分别消化后离心计数,4 000个/ 孔接种于 96孔板,每组 6个复孔,待细胞贴壁后 0､24､48 h 加入 MTS(每孔 20 μL)测定各孔吸光度值,检测细胞增殖能力｡

1. 6 平板划痕试验

检测细胞迁移将处于对数生长 期 的 H1975 / NC 和 H1975 /LINC01140 细 胞 分 别 消 化 后 铺 于 24 孔 板 ( 4 ×105个/ 孔),待细胞融合 70% ~ 80%时,用 10 μL移液器吸头进行细胞划痕,PBS 清洗漂浮细胞,显微镜下分别拍摄 0､24 h划痕宽度,利用 E尺分析:迁移率 =(划痕初始宽度 -划痕目前宽度) / 2 / 划痕初始宽度 × 100%｡

1. 7 Transwell 试验

检测细胞侵袭将 1∶ 6 配制 Matrigel 基质胶轻铺入 Transwell小 室, 置 于 4 ℃ 冰 箱 过 夜｡ 将 对 数 生 长 期 的H1975 /NC和 H1975 / LINC01140细胞分别消化于无血清的培养基中,并计数(1 × 106/mL,每孔 200μL)铺于上室,下室加入 500 μL含高浓度胎牛血清的培养基,24 h 后用 4%甲醛固定,0. 1%结晶紫染色,光学显微镜( × 200)下对 5 个随机视野的细胞进行计数｡

1. 8 统计学方法

应用 GraphPad软件制图,数据采用 SPSS 26.0进行统计,计量资料以均数 ±标准差(x ±s)表示,两组间比较采用 t 检验｡ α = 0. 05为检验水准｡

2、结果

2. 1 肺癌组织中 LINC01140 表达与临床特征､生存的关系

GEPIA网站分析数据库结果显示,与癌旁组织(n =347)相比,肺腺癌( n =483)组织中 LINC01140表达显著下调(P < 0.05);与癌旁组织( n =338)相比,肺鳞癌(n =486)组织中 LINC01140表达显著下调(P < 0. 05)｡ 见图 1｡ UALCAN 数据库分析结果显示,基于性别､年龄､吸烟和肿瘤分期的亚组分析中,肺癌患者 LINC01140表达水平均低于健康者(P < 0.05),见图 2｡ Kaplan⁃Meier Plotter数据库分析结果显示,LINC01140 高表达组与低表达组间总生存率比较差异有统计学意义[ HR = 1. 2 (1. 04,1. 39),P < 0.05],见图 3｡

肺腺癌(n=483)①LINC01140 表达76543210①癌旁组织(n=347)肺鳞癌(n=486)癌旁组织(n=338)与癌旁组织比较,① P < 0. 05｡

图 1 GEPIA网站分析数据库中在肺癌组织及癌旁组织LINC01140 表达水平比较

2. 2 HBE 细胞､H1975 细胞中 LINC01140 表达水平

RT⁃PCR检测结果显示,LINC01140 在人支气管黏膜上皮 细 胞 HBE 中 的 相 对 表 达 量 为 1. 80 ±0.20,在人肺腺癌细胞 H1975中的相对表达量为0. 77 ± 0. 38｡ LINC01140在人支气管黏膜上皮细胞HBE 中的相对表达量高于人肺腺癌细胞 H1975的相对表达量(P < 0. 05)｡ 见图 4｡

2. 3 转染细胞系中 LINC01140 表达水平

RT⁃PCR检测结果显示, H1975 / LINC01140中LINC01140 相对表达水平为 2. 27 ± 0. 57,H1975 /NC中 LINC01140 相 对 表 达 水 平 为 0. 77 ± 0. 25｡H1975 / LINC01140 中 LINC01140 相对表达水平高于 H1975 / NC 中 LINC01140 相对表达水平 ( P <0. 05)｡ 见图 5｡

2. 4 过表达 LINC01140 对 H1975 细胞增殖能力的影响与 H1975 / NC比较,H1975 / LINC01140细胞吸光度值明显升高(P < 0. 05)｡ 见表 1,

图 6｡LINC01140 表达

图 2 UALCAN 数据库中肺癌患者 LINC01140 表达与临床特征的关系时间 

图 4 人支气管黏膜上皮细胞 HBE 和人肺腺癌细胞 H1975中 LINC01140的表达水平·

表 1 2 组人肺腺癌细胞 H1975 不同时间增殖能力比较

图 5 人肺腺癌细胞 H1975 转染细胞系中 LINC01140 的表达水平

图 6 过表达 LINC01140人肺腺癌细胞 H1975 增殖能力的影响

2. 5 过表达 LINC01140 对 H1975 细胞迁移能力的影响

H1975 / NC 和 H1975 / LINC01140细胞迁移率分别为(15. 00 ± 5. 00)%和(37. 50 ± 2. 50 )% ｡ 与H1975 / NC相比,H1975 / LINC01140细胞迁移率增高(P < 0. 05)｡ 见图 7｡H1975/NC H1975/LINC011400 h48 hH1975 / NC为对照组,H1975 / LINC01140 为高表达组｡

图 7 过表达 LINC01140 对人肺腺癌细胞 H1975迁移能力的影响( × 100)

2. 6 过表达 LINC01140 对人肺腺癌细胞 H1975侵袭能力的影响H1975 / NC 和 H1975 / LINC01140穿膜细胞数分别为(28. 30 ± 10.40)个和(80. 00 ± 10. 00) 个｡ 与H1975 / NC相比,H1975 / LINC01140穿膜细胞数明显增多(P < 0. 05)｡ 见图 8｡H1975/NC H1975/LINC01140H1975 / NC为对照组,H1975 / LINC01140 为高表达组｡

图 8 过表达 LINC01140 对人肺腺癌细胞 H1975 侵袭能力的影响( × 200)

3、讨论

3. 1 LINC01140 在肺癌发生发展中的作用奥希替尼是 EGFR突变阳性肺腺癌的一线用药方案, 疗效显著, 然而其耐药问题是肺癌治疗中亟待解决的问题之一｡ lncRNA参与细胞内许多关键的生物学过程[6⁃10],近来有文献报道, LINC01140在多种恶性肿瘤中异常表达, 并参与肿瘤的发生发展[11]｡ LINC01140 通 过 靶 向 miR⁃200b⁃3p 下 调DMD 来抑制乳腺癌细胞的生长[12]; LINC01140 通过靶向 miR⁃139⁃5p / HOXA9轴抑制骨肉瘤细胞的侵袭和增殖[13]; LINC01140在浸润性膀胱癌中显著高表达, 其表达下调通过 LINC01140 / miR⁃140⁃5p /FGF9 轴抑制膀胱癌细胞的侵袭[14]｡ 这可能是由LINC01140 组织特异性引起的, 提示 LINC01140 可能在不同肿瘤类型中具有不同的作用｡ 因其在肺癌中的作用尚不清楚, 我们首先通过 GEPIA 网站､UALCAN 及 Kaplan⁃Meier Plotter数据库进行数据挖掘, 发现 LINC01140 在肺癌组织中低表达, 且与临床特征､ 生存有关, 提示其可能影响肺癌的发生发展; 因此我们选取了人肺腺癌细胞 H1975, 探究其对 肺 癌 细 胞 生 物 学 行 为 的 影 响, 结 果 显 示LINC01140 可以促进肺癌细胞的增殖､ 迁移和侵袭｡ 以上结果提示, LINC01140 可能在肺癌发生发展过程中发挥着癌基因的作用｡2耐药机制分析lncRNA⁃miRNA⁃mRNA 网络作为恶性肿瘤诊断和评估预后的生物标志物和潜在的治疗靶点已被广泛研究[15]｡ LINC01140 可以作为 miRNAs 的 “海绵”, 通过直接吸附 miRNAs来下调其细胞内水平[16⁃19], 从而影响下游靶基因来调控细胞增殖､迁移和侵袭｡ 那么 LINC01140 在肺癌中调控的具体机制及靶 micRNA､ 靶基因如何将是我们后续研究的重点｡同样也有文献提示 lncRNA的表达与肺癌分子靶向药物的耐药和敏感性有关, 如 lncRNACRNDE通过 eIF4A3 / MUC1 / EGFR 信号传导影响 EGFR 突变阳性肺癌细胞 PC⁃9､ HCC827 对奥希替尼的敏感性[20]｡ LINC01128 / miR⁃25⁃3p / PTEN 轴 可 能 通 过PI3K/ Akt 信号通路促进 PC⁃9 细胞对吉非替尼的耐药[21]｡ 众所周知, 奥希替尼为 EGFR T790M突变阳性肺癌的首选方案[22⁃24], 而 H1975 恰恰为 EGFRT790M突变阳性肺癌细胞, 且 DING等[25] 研究发现 LINC00313 / miR⁃218⁃5p / COL1A1 轴 可 能 通 过PI3K/ Akt 信号通路促进 EGFR T790M 突变阳性肺癌细胞 H1975 对奥希替尼的耐药｡ LINC00460 表达上调会降低 H1975 细胞对奥希替尼的敏感性[26]｡基于以上学者的研究结论,再结合我们的研究结果: LINC01140 可以调控 EGFR T790M 突变阳性的肺癌细胞 H1975 的增殖､ 侵袭､ 迁移, 为我们探索其是否影响奥希替尼敏感性提供了前期基础｡

综上所述, LINC01140可以调控肺癌细胞增殖, 迁移和侵袭, 有望成为 NSCLC 靶向治疗的潜在靶点及预后评估的分子标志物｡ 对肺癌患者检测LINC01140 表达情况, 可以为靶向药物的选择提供依据, 从而提高临床效果, 改善患者预后｡4

参考文献:

[9]李泞甫,陈旭澜,曾蓓蕾,等. 奥希替尼靶向治疗晚期非小细胞肺癌临床研究[J]. 中国药业,2024,33(10):101⁃103.

[10]王书芬,程伟岩,党强. 贝伐珠单抗联合奥希替尼治疗伴 EGFRT790M 突变的晚期 NSCLC 的疗效观察[ J].实用癌症杂志,2024,39(4):598⁃601.

[11]刘艳,马秋玲. 长链非编码 RNA LINC01140 在急性髓细胞白血病患者骨髓单个核细胞中的表达及其临床意义[J]. 中国医药,2019,14(12):1834⁃1837.

基金资助:河北省青年科技计划项目(20220882); 河北省政府资助临床医学优秀人才项目(ZF2025031);

文章来源:崔玉洁,张洁,张立晓,等.LINC01140过表达对肺腺癌细胞H1975增殖和侵袭的影响[J].临床误诊误治,2024,37(21):73-78.