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牡荆素调控PI3K/Akt通路对IL-1β诱导的关节软骨细胞凋亡的影响

2024-10-21 71 上传者：管理员

摘要：目的探讨牡荆素对白介素-1β(IL-1β)诱导的关节软骨细胞凋亡的影响及对磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶（AKT）通路的影响。方法体外培养人关节软骨细胞并使用0～200μmol/L的牡荆素处理细胞，筛选最佳浓度；将人关节软骨细胞分为对照组、IL-1β组、牡荆素10μmol/L组、牡荆素50μmol/L组和牡荆素+PI3K抑制剂（LY294002）组，CCK-8法检测各组细胞增殖，流式检测细胞凋亡率，ELISA检测细胞上清液中IL-6和TNF-α的水平，硫代巴比妥酸法测定细胞上清液丙二醛（MDA）的含量，黄嘌呤氧化法测定细胞上清液超氧化物歧化酶（SOD）活性，Western blot法检测细胞中磷酸化（p-）PI3K、PI3K、p-Akt、Akt和剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(C-Caspase-3)蛋白的表达。结果与对照组比较，IL-1β组细胞存活率、SOD活性和p-PI3K/PI3K(0.58±0.06比0.91±0.09)、p-Akt/Akt(0.15±0.03比0.69±0.08)蛋白表达水平降低，细胞凋亡率（38.21%±3.26%比2.88%±0.64%）、IL-6、TNF-α、MDA含量以及C-Caspase-3蛋白表达水平升高（P<0.05）；与IL-1β组比较，牡荆素10、50μmol/L组细胞存活率、SOD活性和p-PI3K/PI3K(0.71±0.08、0.87±0.09比0.58±0.06)、p-Akt/Akt(0.32±0.04、0.59±0.07比0.15±0.03)蛋白表达水平逐渐升高，细胞凋亡率（25.36%±2.94%、18.36%±1.95%比38.21%±3.26%）、IL-6、TNF-α、MDA含量以及C-Caspase-3蛋白表达水平逐渐降低（P<0.05）；与牡荆素50μmol/L组比较，牡荆素+LY294002组细胞存活率、SOD活性和p-PI3K/PI3K(0.61±0.07比0.87±0.09)、p-Akt/Akt(0.19±0.03比0.59±0.07)蛋白表达水平降低，凋亡率[（26.71%±2.78）%比（18.36%±1.95）%]、IL-6、TNF-α、MDA含量以及C-Caspase-3蛋白表达水平升高（P<0.05）。结论牡荆素可能通过激活PI3K/AKT通路抑制IL-1β诱导的关节软骨细胞的凋亡。

关键词：
关节软骨细胞
凋亡
牡荆素
磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶
骨关节炎
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骨关节炎（Osteoarthritis,OA）主要症状是关节疼痛、关节功能障碍。OA患者损伤关节处微环境发生变化，关节腔严重缺氧，过量分泌的炎症因子浸润到关节处，扰乱软骨细胞的代谢平衡，导致软骨细胞凋亡。随着老龄人口的增加，OA的发病率快速增长，目前全球患者已超3亿人，寻找靶向治疗OA的方式十分重要[1⁃2]。牡荆素属于黄酮类化合物，主要来源于蔓荆子和山楂，可有效改善血液循环、抑制炎性生物酶渗出、降低胆固醇、清除自由基，在改善心肌梗死、抗肿瘤、抑菌等方面显现出强大的药理作用[3]。紫花牡荆素也是蔓荆子的主要提取物，研究发现，紫花牡荆素可抑制OA模型小鼠软骨下骨破骨细胞的形成，缓解软骨下骨及软骨退变，改善OA[4]。激活磷脂酰肌醇3⁃激酶（Phosphatidylinositol 3⁃kinase,PI3K）及其下游分子蛋白激酶（Protein kinase B,AKT）可以促进间充质干细胞增殖和软骨分化，修复OA病变[5]。牡荆素对OA及软骨细胞的影响尚不清楚。因此，本文将探讨牡荆素对OA及软骨细胞的作用及PI3K/Akt通路的影响，以期为OA的治疗提供参考。

1、材料与方法

1.1材料

人关节软骨细胞（原代细胞，货号SNP⁃H103），购自尚恩生物。牡荆素（纯度≥98%，货号3681⁃93⁃4，源叶生物）、白介素⁃1β（货号GF331）（美国Merck）、PI3K抑制剂LY294002（货号HY⁃10108，美国MCE），人IL⁃6ELISA试剂盒（货号ml058097）、人肿瘤坏死因子（TNF）⁃α ELISA试剂盒（货号ml077385）（酶联生物），一抗磷酸化（p⁃）PI3K（货号ab182651）、PI3K（货号ab302958）、p⁃Akt（货号ab38449）、Akt（货号ab8805）、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(C⁃Caspase⁃3，货号ab32042）（美国Abcam），等。

1.2方法

1.2.1细胞培养及筛选牡荆素浓度

使用完全培养基培养人原代关节软骨细胞至铺满瓶底，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，传代培养。取第2代软骨细胞，接种至96孔板，24 h后，向细胞孔中分别加入0、10、25、50、100、200μmol/L的牡荆素，24 h后加入10μL CCK⁃8溶液，孵育4 h，检测450 nm波长处光密度（A），评价细胞存活率。

1.2.2细胞分组

将第2代关节软骨细胞分成对照组、IL⁃1β组、牡荆素10μmol/L组、牡荆素50μmol/L组和牡荆素+LY294002组。IL⁃1β组、牡荆素10μmol/L组、牡荆素50μmol/L组、牡荆素+LY294002组在细胞中加入10 ng/mL的IL⁃1β培养24h[6]；随后牡荆素10μmol/L组、牡荆素50μmol/L组分别加入10、50μmol/L牡荆素培养24 h，牡荆素+LY294002组加入50μmol/L牡荆素和25μmol/L LY294002培养24 h[7]；对照组细胞常规培养。CCK⁃8法检测各组细胞增殖。

1.2.3细胞凋亡率检测

在上述各组细胞中加入胰蛋白酶消化后，统一细胞浓度，取100μL细胞悬液至Falcon试管，再加入Annexin V⁃FITC和PI工作液，暗处静置15 min，最后加入结合缓冲液，静置1 h，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 IL⁃6、TNF⁃α水平检测

取1.2.2中各组细胞上清液，使用ELISA试剂盒按标准操作步骤检测上清液中IL⁃6、TNF⁃α的水平。

1.2.5 MDA含量和SOD活性检测

硫代巴比妥酸法使用MDA试剂盒测定1.2.2中各组细胞上清液中MDA的含量，黄嘌呤氧化法使用SOD试剂盒测定上清液中SOD的活性。

1.2.6 p⁃PI3K、PI3K、p⁃Akt、Akt、C⁃Caspase⁃3蛋白表达检测

取1.2.2中各组细胞，Western blot法检测各蛋白的表达。使用PAGE凝胶作为电泳载体，将样品蛋白条带转至PVDF膜，封闭PVDF膜后分别置于各抗体稀释液中过夜，室温下孵育二抗和发光液，根据灰度值分析蛋白表达水平。

1.3统计分析

所有数据以均值±标准误（Mean±SE）表示并使用GraphPad Prism 8.0.2分析，多组间差异采用单因素方差分析比较，组间两两比较采用LSD⁃t检验。P<0.05认为有统计学意义。

2、结果

2.1不同浓度牡荆素处理关节软骨细胞的细胞活率比较

与0μmol/L组细胞活率（100.00%±0.00%）比较，10、25、50μmol/L组细胞活率（分别为98.50%±1.06%、96.48%±2.25%、94.45%±5.05%）差异无统计学意义（P>0.05),100、200μmol/L组细胞活率（分别为84.31%±10.11%、60.18%±8.03%）降低（F=41.719,P<0.05），后续采用10、50μmol/L浓度的牡荆素处理关节软骨细胞。

2.2各组细胞活率比较

与对照组细胞活率（100.00%±0.00%）比较，IL⁃1β组（54.13%±7.20%）降低（P<0.05）；与IL⁃1β组比较，牡荆素10、50μmol/L组细胞活率（分别为65.41%±7.42%、83.10%±9.33%）逐渐升高（P<0.05）；与牡荆素50μmol/L组比较，牡荆素+LY294002组细胞活率（57.36%±6.75%）降低（P<0.05）。

2.3各组细胞凋亡率比较

与对照组比较，IL⁃1β组细胞凋亡率升高（P<0.05）；与IL⁃1β组比较，牡荆素10、50μmol/L组细胞凋亡率逐渐降低（P<0.05）；与牡荆素50μmol/L组比较，牡荆素+LY294002组细胞凋亡率升高（P<0.05）（图1）。

图1不同浓度牡荆素处理对关节软骨细胞凋亡率的影响（流式细胞术检测）

2.4不同浓度牡荆素处理对关节软骨细胞IL⁃6、TNF⁃α水平的影响

与对照组比较，IL⁃1β组IL⁃6、TNF⁃α水平升高（P<0.05）；与IL⁃1β组比较，牡荆素10、50μmol/L组IL⁃6、TNF⁃α水平逐渐降低（P<0.05）；与牡荆素50μmol/L组比较，牡荆素+LY294002组IL⁃6、TNF⁃α水平升高（P<0.05）（表1）。

2.5不同浓度牡荆素处理对关节软骨细胞MDA含量、SOD活性的影响

与对照组比较，IL⁃1β组MDA含量升高，SOD活性下降（P<0.05）；与IL⁃1β组比较，牡荆素10、50μmol/L组MDA含量逐渐降低，SOD活性逐渐升高（P<0.05）；与牡荆素50μmol/L组比较，牡荆素+LY294002组MDA含量升高，SOD活性下降（P<0.05）（表2）。

表1不同浓度牡荆素处理对关节软骨细胞IL⁃6、TNF⁃α水平的影响（ng/L,Mean±SE)

2.6不同浓度牡荆素处理对关节软骨细胞p⁃PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、C-Caspase-3蛋白表达的影响

与对照组比较，IL⁃1β组p⁃PI3K/PI3K、p⁃Akt/Akt蛋白表达水平降低，C⁃Caspase⁃3蛋白表达水平升高（P<0.05）；与IL⁃1β组比较，牡荆素10、50μmol/L组p⁃PI3K/PI3K、p⁃Akt/Akt蛋白表达水平逐渐升高，C⁃Caspase⁃3蛋白表达水平逐渐降低（P<0.05）；与牡荆素50μmol/L组比较，牡荆素+LY294002组p⁃PI3K/PI3K、p⁃Akt/Akt蛋白表达水平降低，C⁃Caspase⁃3蛋白表达水平升高（P<0.05）（图2）。

表2不同浓度牡荆素处理对关节软骨细胞MDA含量、SOD活性的影响（Mean±SE)

图2不同浓度牡荆素处理对关节软骨细胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、C-Caspase-3蛋白表达的影响

(Western blot检测)*与对照组比较，*P<0.05；#与IL-1β组比较，#P<0.05；☆与牡荆素10μmol/L组比较，☆P<0.05；△与牡荆素50μmol/L组比较，△P<0.05;n=6

3、讨论

OA是常见的慢性关节病，是造成老年人活动能力受限的主要原因之一，目前除全关节置换术外，还没有完全有效治疗OA的方法[8⁃10]。OA发生的主要原因是软骨细胞代谢失衡，细胞因子以及其他介质被认为会触发软骨细胞的致病机制，促进细胞凋亡和分解酶的表达，导致细胞外基质逐渐退化[11-13]。IL⁃1β是一种促炎细胞因子，常被用来诱导软骨细胞凋亡[14]。本研究亦使用IL⁃1β构建损伤关节软骨细胞模型，细胞凋亡率和炎症因子IL⁃6、TNF⁃α水平升高，说明细胞受到损伤，出现炎症反应，此处理方法可行，在此基础上进行下一步探究。牡荆素具有典型的黄酮类化合物生物活性，已经证明可以用于抑制肿瘤、改善酒精性脂肪肝、促进微生物循环等[15]。本研究分别使用10、50μmol/L牡荆素处理IL⁃1β诱导后的关节软骨细胞，均能抑制炎症因子的水平和细胞凋亡率，提高细胞存活率，说明牡荆素对IL⁃1β诱导后的软骨细胞损伤具有改善作用。

应激条件下，高浓度的活性氧产生MDA,SOD则能清除过多的活性氧，保护细胞免受损伤[16]。本研究也发现，IL⁃1β诱导后的软骨细胞MDA含量升高，SOD活性降低，提示软骨细胞在外界环境刺激下发生氧化应激，胞内活性氧过量，高表达的MDA以及紧缺的SOD不能消化过多的活性氧，加剧氧化因子对细胞的伤害，促进细胞的凋亡。细胞凋亡的关键执行者是Caspase⁃3,Caspase⁃3被激活形成C⁃Caspase⁃3后直接启动细胞凋亡[17⁃18]。本研究发现IL⁃1β诱导软骨细胞后C⁃Caspase⁃3蛋白水平升高，说明凋亡率增加，与前述分析结果一致；牡荆素干预后，损伤细胞的氧化应激水平以及C⁃Caspase⁃3蛋白水平下降，说明牡荆素能够缓解细胞内的氧化水平，降低细胞凋亡率，但其具体作用通路还不清楚。

已有文献提出，OA兔模型软骨细胞中PI3K/Akt通路被抑制[19]。PI3K由调节亚基p85和催化亚基p110构成，PI3K与生长因子受体结合后，使下游分子Akt活化，以磷酸化作用调控下游多个底物的活性，进而调节细胞的生理进程[20]。增加PI3K和AKT磷酸化的程度可以诱导骨髓干细胞软骨细胞的分化，可以作为预防OA发生和进展的治疗靶点[21]。本研究在IL⁃1β诱导的关节软骨细胞中发现p⁃PI3K/PI3K、p⁃Akt/Akt蛋白表达水平下降，提示PI3K/AKT通路被抑制，PI3K和AKT磷酸化进程受阻可能难以激活下游底物，细胞生长代谢过程受阻，部分软骨细胞因此凋亡；牡荆素干预后，p⁃PI3K/PI3K、p⁃Akt/Akt蛋白水平显著升高，PI3K/AKT轴激活；PI3K抑制剂LY294002和牡荆素共同干预IL⁃1β诱导的软骨细胞，细胞增殖及PI3K/AKT信号水平下降、细胞凋亡和氧化水平升高，说明LY294002不单单对PI3K/AKT信号有抑制作用，还会抵消掉牡荆素的干预作用，表明牡荆素对IL⁃1β诱导的软骨细胞保护作用可能是通过激活PI3K/AKT通路实现的。

综上所述，牡荆素可能通过激活PI3K/AKT通路抑制IL⁃1β诱导的关节软骨细胞的凋亡。牡荆素在体内的作用可能受到吸收、代谢等多方面影响，本研究只停留在细胞层面，后续需要在动物模型上进一步验证，明确其对OA更准确的影响效果。

作者贡献声明罗鹏负责科研设计、数据分析及文章撰写、修改；吴钒负责实验指导及文章审阅；陈佳伟、万震宇负责实验实施、数据收集及协助文章审阅

利益冲突声明所有作者声明均不存在利益冲突

参考文献:

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