结肠癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤，据统计，2020年全球约有190万新增结肠癌患者，93.5万结肠癌相关死亡，分别占全球癌症病例的10%和癌症相关死亡的9.4%[1]。随着现代医学对结肠癌生理病理认知的不断加深，各种筛查与治疗方法经过优化，已有效提高了患者的5年生存率，然而，近40%的结肠癌患者仍会复发或出现转移的情况[2-3]。免疫治疗是利用宿主免疫系统的内在机制杀灭肿瘤细胞的治疗方法，通过改变肿瘤微环境、诱导特异性抗肿瘤免疫，能够在一定程度上降低癌症的复发与转移概率，效果显著[4-5]。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte, TIL)包括T淋巴细胞(T-lymphocyte)、B淋巴细胞、自然杀伤细胞(natural killer cells, NK)等，具有识别肿瘤抗原并杀死肿瘤细胞的能力，是肿瘤免疫应答机制的重要影响因素之一，多种实体肿瘤TIL与患者预后情况相关[6-8]。铁死亡有别于细胞凋亡、坏死和自噬，是一种氧化性、铁依赖的细胞死亡形式，由谷胱甘肽(glutathione, GSH)依赖的抗氧化防御机制失活，引发细胞内过度积累脂质活性氧(reactive oxygen species, ROS),导致氧化死亡[9-10]。南蛇藤提取物(Celastrus orbiculatus extracts, COE)是从传统中药南蛇藤的多个部位分离出的提取物，具有很强的抗肿瘤、抗炎、细胞毒性[11],目前有关COE与TIL及铁死亡相关的研究较少。本次研究提取了结肠癌患者癌组织中的TIL,通过体内外实验观察COE对TIL铁死亡及GSH信号通路的影响，现报道如下。

1、材料与方法

1.1组织标本

收集2022年4月至2022年7月经手术切除的22例结肠癌样本，均经术后病理诊断确诊为结肠癌[12]。所有患者临床资料完整，术前均未接受放、化疗。男13例，女9例，年龄(55.29±8.43)岁(41～68岁)。本次研究已通过我院伦理委员会批准，批号：科伦[2022]35号，所有患者均知情同意并自愿提供组织样本。

1.2实验动物

48只SPF级5周龄健康雄性BALB/c裸鼠，体质量(20±2)g,购自安徽医科大学动物实验中心，动物合格证号SCXK(皖)2022-004。于SPF房内适应性饲养1周后进行实验，饲养期间允许大鼠自由摄食饮水。实验中的所有操作均在动物实验伦理指导守则指导下进行。

1.3实验细胞

人结肠癌细胞株SW480(CL-0223B)、HCT-116(CL-0096)均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.4研究材料

南蛇藤饮片(220105)购自徐州恒合生物科技有限公司；RPMI-1640培养基(11875119)、Ⅳ型胶原酶(17104019)、脱氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonucleaseⅠ,DNaseⅠ,18047019)、胎牛血清(16140063)均购自美国Thermo Fisher公司；透明质酸酶(E0037)购自上海宝曼生物科技有限公司；淋巴细胞分离液(YLK-SJ2305D)购自优利科(上海)生命科学有限公司；红细胞裂解液(40401ES60)购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；重组白细胞介素-2(recombinant interleukin-2,rIL-2,C013)购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司；CD3-PerCpCy5.5(300430)、CD4-FITC(555346)、CD8-BV510(344732)、CD56-PE(555516)、AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒(556547)均购自美国BD公司；铁死亡诱导剂Erastin(UE329600)购自北京德航五洲科技有限公司；MTT检测试剂盒(M1020)购自北京索莱宝科技有限公司；GSH(A006-2-1)、ROS(E004-1-1)、丙二醛(malondialdehyde, MDA,A003-1-2)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；CD3单克隆抗体(Orthoclone, OKT3,ab210317)、二价金属离子转运体1(divalent metal transporter 1,DMT1,ab55735)、转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TFR1,ab214039)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4,ab125066)均购自英国Abcam公司；抗CD28抗体(CD8-M120b)购自北京百普赛斯生物科技股份有限公司。其他试剂均为市售分析纯。

1.5实验方法

1.5.1 COE的制备[13]:

南蛇藤饮片粉碎后使用95%乙醇回流法提取3次，回收溶剂，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取3次，溶剂经减压浓缩后真空冻干，即获得COE。使用时加入二甲基亚砜溶解COE,1 g乙酸乙酯提取物相当于60 g生药量。

1.5.2 TIL的分离培养：

取手术切取的新鲜结肠癌组织5～8 g,浸泡于含抗生素的RPMI-1640培养基中暂存，于4 h内提取细胞。结肠癌组织剪碎后加入含0.05%Ⅳ型胶原酶、0.01%透明质酸酶、0.002% DNaseⅠ的无菌RPMI-1640培养基中，于37℃环境中摇床消化1 h后用40μm细胞过滤器过滤。收集滤液，450×g离心10 min,弃上清，重悬细胞后将细胞悬液缓慢加入等体积淋巴细胞分离液上层，(750～850)×g、加减速度设为上4下2,离心30 min。吸取中间层淋巴细胞，350×g离心7 min弃上清，洗涤2次。加入适量红细胞裂解液，裂解12 min后160×g离心5 min,弃上清。使用含100 g/L胎牛血清、6 000 IU/mL rIL-2的RPMI-1640培养基(完全培养基),于37℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度的培养箱中培养72 h。使用包被1μg/mL OKT3的6孔板接种TIL,完全培养基加入2μg/mL抗CD28抗体，培养72 h后，半量更换含6 000 IU/ml rIL-2的RPMI-1640培养基。TIL细胞总数达到约1×107个时，转入包被1μg/mL OKT3的培养袋中培养，定期更换培养基。

1.5.3 TIL的鉴定与分组：

(1)鉴定：取适量TIL离心，加入100μL 1×PBS重悬，加入10μL CD3、CD4、CD8、CD56流式抗体，避光反应30 min后500×g离心5 min,洗涤2次，加入200μL 1×PBS重悬，上机检测。(2)分组：TIL分为对照组、COE组、COE+Erastin组，对照组正常培养，COE组培养基中加入40 mg/L COE,COE+Erastin组培养基中加入40 mg/L COE和10μmol/L Erastin,正常培养48 h用于后续实验。

1.5.4 MTT检测细胞存活率：

不同剂量的COE对TIL毒性：将TIL分为0、10、20、40、80、160、320 mg/L组，按照分组名称向培养基中加入100μL对应浓度COE,正常培养24、48、72 h后进行MTT检测。每孔加入10μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，37℃孵育4 h,加入100μL二甲基亚砜，避光震荡15 min,酶标仪570 nm测定吸光度(OD)值。

体外结肠癌细胞杀伤能力：各组TIL作为效应细胞，SW480、HCT-116作为靶细胞，细胞密度均调整为2×106个/mL,按10∶1的比例混合效应细胞与靶细胞，正常培养24 h后进行MTT检测，具体操作同上。另设置单独培养的各组TIL与SW480、HCT-116作为对照，计算各组TIL杀伤能力=1-(混合细胞OD值-各组TILOD值)/靶细胞OD值。

1.5.5流式细胞术检测TIL凋亡情况：

各组TIL加入Binding Buffer调整细胞浓度为1×106个/mL,加入5μL Annexin V-FITC、5μL PI,避光反应30 min,上机检测。

1.5.6 GSH、ROS、MDA水平测定：

收集各组TIL,按照相应生化检测试剂盒说明书中的要求完成样本的前处理与实验操作，检测TIL GSH、ROS、MDA水平。

1.5.7 Western Blotting检测DMT1、TFR1、GPX4蛋白表达水平：

收集各组TIL,加入适量预冷裂解液，充分裂解后于4℃、11 180×g离心10 min,取上清液进行BCA定量。凝胶电泳分离样品蛋白，转膜，截取目的条带浸于50 g/L脱脂奶粉制成的封闭液中，置于摇床上室温封闭1 h。检测DMT1、TFR1、GPX4,封闭液稀释一抗制成孵育液，稀释比例为1∶500,充分摇匀后置于4℃环境下过夜。第二天取出膜，平衡至室温后洗膜，加入稀释比例为1∶5 000的对应二抗孵育液，室温孵育2 h,洗膜后加入ECL化学发光液，避光反应5 min,用定量成像仪收集结果。

1.5.8体内异种移植实验：

48只裸鼠根据不同肿瘤细胞平均分为两部分，每部分分为空白组、对照组、COE组、COE+Erastin组，每组6只。所有裸鼠按照分组于左侧腹部皮下接种细胞密度为2×106个/mL的SW480或HCT-116,正常饲养1周后，对照组、COE组、COE+Erastin组接受尾静脉注射2×106个/mL相应TIL,空白组尾静脉注射等体积1×PBS。每隔3 d测量1次肿瘤体积，计算公式：体积=1/2(长×宽2)。21 d后处死裸鼠，完整取出肿瘤并称重记录。实验过程中无裸鼠死亡。

1.6统计学方法

采用SPSS 24.0统计软件对数据进行分析处理，计量资料使用表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 TIL鉴定结果

结肠癌组织TIL以CD3+T细胞为主，CD8+T细胞次之，CD4+T细胞和NK细胞(CD3-CD56+)较少(见图1)。

图1 TIL鉴定结果

2.2 COE对TIL增殖与体外杀伤能力的影响

细胞毒性测试结果显示，与各时间点0 mg/L组相比，10、20、40、80 mg/L组细胞相对存活率均升高(P<0.05),160 mg/L组培养48 h、72 h, 320 mg/L组各时间点细胞相对存活率降低(P<0.05)。各时间点40 mg/L组细胞相对存活率最高，因此，后续检测中COE剂量设定为40 mg/L。体外杀伤能力检测结果显示，与SW480、HCT-116对照组相比，COE组、COE+Erastin组杀伤能力增强(P<0.05);与COE组相比，COE+Erastin组杀伤能力减弱(P<0.05,见图2)。

2.3 COE对TIL凋亡的影响

流式凋亡检测结果显示，与对照组相比，COE组、COE+Erastin组细胞凋亡水平下降(P<0.05);与COE组相比，COE+Erastin组细胞凋亡水平上升(P<0.05,见图3)。

2.4 COE对TIL GSH、ROS、MDA水平的影响

生化检测结果显示，与对照组相比，COE组、COE+Erastin组GSH水平升高(P<0.05),ROS、MDA水平下降(P<0.05);与COE组相比，COE+Erastin组GSH水平降低(P<0.05),ROS、MDA水平提高(P<0.05,见图4)。

图2 COE对TIL增殖与体外杀伤能力的影响

图3 COE对TIL凋亡的影响

图4 COE对TIL GSH、ROS、MDA水平的影响

2.5 COE对TIL DMT1、TFR1、GPX4蛋白表达的影响

Western blotting检测结果显示，与对照组相比，COE组、COE+Erastin组DMT1、TFR1蛋白表达水平降低(P<0.05),GPX4蛋白表达水平升高(P<0.05);与COE组相比，COE+Erastin组DMT1、TFR1蛋白表达水平升高(P<0.05),GPX4蛋白表达水平降低(P<0.05,见图5)。

图5 COE对TIL DMT1、TFR1、GPX4蛋白表达的影响

2.6 COE增强TIL体内抑癌能力

体内异种移植实验结果显示，与SW480、HCT-116空白组相比，对照组、COE组、COE+Erastin组肿瘤生长速度减缓，体积、体质量减小(P<0.05);与对照组相比，COE组、COE+Erastin组肿瘤生长速度进一步减缓，体积、体质量进一步减小(P<0.05);与COE组相比，COE+Erastin组肿瘤生长速度提升，体积、体质量增大(P<0.05,见图6)。

图6 COE增强TIL体内抑癌能力

3、讨论

随着完整系膜切除手术和(新)辅助化疗在结肠癌治疗中的逐渐应用，结肠癌已经获得了较大的生存改善，但仍有大量患者在术后出现局部复发和/或远处转移[14]。免疫治疗是利用人体自身免疫系统攻击癌症的治疗方法，在黑色素瘤、非小细胞肺癌等实体肿瘤的治疗中效果显著[15-16]。TIL为自然渗入实体瘤的一类异质淋巴细胞群体，使用TIL的过继性细胞免疫治疗(adoptive cellular immuno-therapy, ACI)是通过分离肿瘤组织内部天然存在的TIL,经过体外扩增后将TIL回输给患者以杀灭肿瘤细胞的治疗方法，对原发性肿瘤、转移性肿瘤均有一定效果[17]。TIL不仅能够有效杀灭肿瘤肿瘤细胞，还能影响肿瘤微环境，提高患者机体免疫力，安全性相对较高，临床应用前景广阔[18]。但目前尚缺乏高效提取、短时间大量扩增、延长并增强TIL抗癌功能的手段与方法，仍需不断探索研究。

铁死亡是由铁催化使细胞膜磷脂中多不饱和脂肪酸发生过氧化反应产生过氧化脂质，过氧化脂质诱导膜破裂，增加膜通透性，导致细胞死亡的非凋亡性形式，在癌症和多种退行性疾病中发挥着重要作用[19-20]。近年来，通过对致癌途径、代谢重编程的深入理解，有关提高癌细胞铁死亡敏感性方面的研究已取得了实质性进展[21]。GPX4以GSH为底物，将过氧化脂质还原为相应的醇，从而降低过氧化脂质水平，是对抗铁死亡的机制之一[22]。已有多项研究证明，抑制GSH信号通路诱导铁死亡能够有效清除耐药癌细胞[23-24]。然而，存在于肿瘤微环境中的免疫细胞与癌细胞具有相似的生长信号和代谢特性，使用铁死亡诱导剂同样会影响免疫细胞的功能与生存能力[25-26]。中草药含有多糖、萜类、生物碱等多种天然成分，通过多途径、多靶点、整体协调的方式治疗各类疾病，提高机体免疫力，使用中药辅助癌症治疗可有效提升患者T细胞亚群免疫功能[27]。已有研究表明，益母草、姜黄等多味中药的主要成分具有调节铁死亡相关分子途径的作用[28-29]。本次研究结果显示，在一定浓度范围内，COE能够增强TIL体外存活能力与杀伤能力，减少TIL凋亡，降低TIL氧化应激水平，抑制促铁死亡相关蛋白DMT1、TFR1表达并提高GPX4表达。体内实验结果显示，经COE处理的TIL抑瘤效果明显增强，提示COE能够有效增强TIL体外增殖、体内外抗肿瘤效果。在使用COE处理TIL时进一步添加Erastin诱导TIL铁死亡，观察到TIL表现出一定的铁死亡抵抗效果，体外存活、杀伤能力、凋亡情况、氧化应激等指标虽较COE组有所下降，仍优于对照组，表现出较强的抑瘤效果，推测COE通过增强GSH信号通路相关分子表达水平抑制TIL铁死亡，从而延长并增强TIL增殖、抗肿瘤效果。其可能的作用机制如图7所示。

图7 COE通过增强GSH信号通路抑制TIL铁死亡的具体机制

综上所述，COE能够通过增强GSH信号通路抑制TIL铁死亡，延长TIL体外增殖能力，进而增强对结肠癌细胞的杀伤效果。但COE成分仍较为复杂，还可能通过其他信号通路影响TIL增殖与抗癌能力，还需更加细致、深入的研究验证。

参考文献:

[12]中华人民共和国国家卫生健康委员会医政医管局,中华医学会肿瘤学分会.中国结直肠癌诊疗规范(2020年版)[J].中国实用外科杂志,2020,40(6):601-625.

[13]高娟,刘钰,邢海洲.南蛇藤提取物对多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的作用及机制[J].中国药理学通报,2022,38(8):1260-1265.

[27]王荟荟,李惠,张延英,等.中医药辅助癌症免疫治疗的研究进展[J].中国比较医学杂志,2023,33(3):130-135.

基金资助:武汉市卫健委医学科研项目(WX21A11);武汉市卫健委医学科研项目(WX23Z23);

文章来源:郭建辉,李晓辉,王辰啸,等.南蛇藤提取物对结肠癌肿瘤浸润淋巴细胞抗肿瘤效果的影响及机制[J].胃肠病学和肝病学杂志,2024,33(10):1329-1334.