临床上由严重创伤、骨感染、缺血性骨坏死、骨肿瘤、导致的骨缺损十分常见，而针对骨缺损的修复一直是困扰临床的难点问题[1]。目前骨缺损的治疗手段主要是利用骨移植或骨替代材料来修复骨缺损和促进骨愈合。自体或异体骨移植在临床中最为常用，但骨移植存在来源受限、二次创伤、免疫排斥反应及传染性疾病等缺陷，而骨替代材料存在成骨活性弱、机械强度不够、降解性、生物相容性不一、费用偏高诸多问题[2-3],这些缺陷限制他们在临床上的应用，因此设计具有良好生物特性的骨修复替代材料是目前骨组织工程亟待解决的问题。

目前大部分支架材料设计仅考虑了宏观需求，而忽视了微观结构，尤其是仿生微观结构研究更少。近年来随着自然界/生物体多种界面的微环境产生的特殊生物学效应被重新认识及利用，如模拟荷叶表面的微纳结构实现超疏水效应，血管内皮表面微纳界面能够发挥抗黏附效应等，微观层次的仿生逐渐成为生物医学和组织工程学中新的关注点。微观形貌对维持间充质干细胞形态和表型有重要的作用，细胞所处环境中的微观形貌可影响细胞行为，因此利用组织工程技术，制备最大限度模拟骨基质形貌的骨修复替代材料，以期其能引导细胞增殖、分化、迁移等重要行为，进而更好地修复缺损组织，有望成为骨组织工程学中的发展方向[4-5]。

本研究以骨基质形貌参数为指导，使用静电纺丝(electrostatic spinning, ES)技术，以聚乳酸(polylactic acid, PLA)为原料，制备微观形貌仿生的聚乳酸纤维膜，研究仿生微观形貌对大鼠BMSCs生物学行为的影响，旨在获得微观形貌上高度模拟天然骨基质，骨诱导能力和生物相容性良好的仿生骨修复支架材料，寻找利于间充质干细胞成骨分化的微观形貌范围，以期为骨组织工程修复材料微观形貌设计提供理论依据。

1、材料与方法

1.1实验动物及主要试剂、仪器

SPF级SD大鼠，封闭群，4周龄，质量180～210g,雌雄无限制。

聚乳酸(PLA,分子量8万～10万，深圳光华伟业股份有限公司);纯氯仿(98%,广东省化学试剂研发中心);DMEM/F12培养基(低糖)、胰蛋白酶-EDTA、澳洲胎牛血清(FBS)、双抗(青链霉素)、多聚甲醛(GIBCO公司，美国);FITC标记的小鼠抗大鼠CD44抗体、PE标记的小鼠抗大鼠CD45抗体、APC标记的小鼠抗大鼠CD90抗体(Ebioscience公司，美国);异丙醇、4-甲基-2-戊酮、细胞裂解液、CCK-8试剂盒(南京建成生物技术有限公司);Trizol总RNA提取试剂盒(Invitrogen公司，美国);荧光定量PCR试剂盒(KAPA Bio,美国);cDNA第一链合成试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司];大鼠骨桥蛋白(OPN)抗体、骨钙素(OC)抗体Western blot试剂盒(Santa Cruz公司，美国);BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

NF-500静电纺丝机(南京飙鲛科技实业有限公司);Quanta 2000扫描电子显微镜(FEI公司，德国);TE2000U倒置荧光显微镜(Nikon公司，日本);CX23光学显微镜(Olympus公司，日本);T100 Thermal Cycler PCR仪、Mini-Protean Tetra蛋白电泳仪(Bio-Rad公司，美国);FACS Vantage流式细胞仪(Becton-Dickinson公司，美国);Infinite M200 Pro荧光酶标仪(Tecan公司，瑞士);BHC-1300IIA/B2超净工作台(苏州净化工作台设备有限公司);Multifuge X1高速冷冻离心机、HERAcell 2401细胞培养箱(Thermo Scientific公司，美国)。

1.2 BMSCs分离培养及鉴定

取8只SD大鼠脱颈处死，分离股骨，用完全培养基(含10%FBS的DMEM/F12)冲洗骨髓腔，以离心半径3cm、1 000r/min离心15min,弃上清，完全培养基重悬细胞后，种植于培养瓶中，置于37℃、5%CO2及80%相对湿度条件下培养，2～3d后完全培养基全量换液1次，待细胞接近80%～90%汇合时，以1∶3比例传代培养。取第2代BMSCs消化均匀，PBS重悬细胞后计数，调整密度为5×109个/mL,EP管中加入1mL悬液，以离心半径3cm、1 000r/min离心4min;去除上清，每管中分别加入50μL PBS,再分别加入FITC标记的小鼠抗大鼠CD44抗体、PE标记的小鼠抗大鼠CD45抗体、APC标记的小鼠抗大鼠CD90抗体各3μL,室温下避光孵育30min,流式细胞仪检测。

1.3不同形貌聚乳酸纤维膜的制备、表征及仿生聚乳酸纤维膜的筛选

1.3.1不同形貌聚乳酸纤维膜的制备。

将聚乳酸氯仿以不同质量配比，搅拌、溶解得到浓度为4%、5%的聚乳酸溶液；将纺丝液注入纺丝装置中的注射器内(19号针头，直径1.4mm),推进速度为1.5mL/h,接收距离(12cm, 15cm),电压(18kV,22kV),接收时间(1h, 2h)制备不同形貌的聚乳酸纤维膜，真空干燥，裁剪，收集备用。

1.3.2不同形貌聚乳酸纤维膜的表征。

将聚乳酸纤维膜剪成适当大小(约0.5cm×0.5cm),乙醇梯度脱水，CO2临界点干燥，45mA电流喷金30s,加速电压20kV行扫描电镜，不同倍数放大，选择合适图片拍照；应用电脑自带专业分析软件(imageJ 2.0)分析5个图片，每个图片随机选取10～15个纤维测量直径，取均值为纤维直径。

1.3.3仿生聚乳酸纤维膜的筛选。

前期课题组成员表征了骨界面的微观形貌，发现骨基质微环境主要粗细大致均匀、一定直径的胶原纤维交联成网状结构并相互层叠而成，具有不同于宏观骨表面形貌特征，并对三个样本骨小梁表面胶原纤维进行了测量，得到直径区间为198～365nm[6],符合文献报道的100～500nm范围[7],以此为参考，认为呈网状结构，纤维直径在198～365nm区间、纤维粗细均匀的纤维膜更为仿生。

1.4实验分组

参考相关文献[6-9],选择了纤维膜直径在198～365nm区间内为仿生组[A组：(357±32)nm];直径小于此区间为有形貌对照组1[B组：(164±13)nm];直径大于此区间为有形貌对照组2[C组：(1 311±93)nm];普通培养板为无形貌空白对照组(Ctrl组);在成骨分化实验时增设成骨诱导组(Positive组)。取第3代大鼠BMSCs,按1×105个/mL密度接种于覆盖各组纤维膜的细胞培养板上(纤维膜大小裁剪成与培养板孔相当),空白孔不覆盖纤维膜，加入适量完全培养基，置于37℃、5%CO2及80%相对湿度的培养箱中培养，2～3d换液1次。

1.5各组生长、黏附、增殖及成骨分化观察

1.5.1 BMSCs生长、铺展观察。

培养7d,各组取rBMSCs-纤维膜或细胞培养板复合物，2.5%戊二醛固定过夜，乙醇梯度脱水，真空干燥，45mA电流喷金30s,加速电压20kV行扫描电镜，观察细胞生长、铺展情况。

1.5.2 CCK-8试剂盒检测BMSCs黏附情况。

培养4h、8h、16h,各组取BMSCs依照CCK-8试剂盒说明书，用酶标仪在450nm波长处检测不同组的OD值，以650nm波长作为参比波长进行双波长测定，测得各孔OD平均值。

1.5.3 CCK-8试剂盒检测BMSCs增殖情况。

培养1d、3d、5d、7d、9d,各组取BMSCs依照CCK-8试剂盒说明书，用酶标仪在450nm波长处检测不同组的OD值，以650nm波长作为参比波长进行双波长测定，测得各孔OD平均值。

1.5.4实时荧光定量PCR检测Runx2、Ⅰ型胶原(COLI)、碱性磷酸酶(ALP)、锌指结构转录因子(OSX)mRNA的表达。

培养3d、10d,各组收集细胞，Trizol提取总RNA,以两步法进行实时荧光定量PCR分析，采用2-ΔΔCt法定量分析Runx2、COLI、ALP、OSX mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.5.5蛋白质印迹法(Western Blot)检测骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OC)的表达。

培养10d,各组收集细胞，依照大鼠OPN抗体、OC抗体试剂盒说明书，进行Western blot,检测OPN、OC蛋白相对表达水平。

1.6统计学方法

所有数据均使用SPSS18.0软件进行处理，多个样本均数间比较的方差分析，计量资料以

表示，组间差异采用t检验，P<0.05认为差异具有统计学意义，P<0.01认为差异具有显著统计学意义。

2、结果

2.1 BMSCs分离培养及鉴定

培养板上，刚分离接种的细胞分布均匀，含大量脂肪细胞，镜下折光性强，成圆形悬浮生长(见图1a),5d左右达80%融合，1∶3传代。第2代BMSCs贴壁生长良好，呈典型“纺锤体样”外观，细胞相互靠近融合，呈“鱼群样”(见图1b)。

图1显微镜下细胞观察

a.刚分离接种的细胞(×40);b.P2代BMSCs(×100)。

流式细胞仪检测大鼠第2代BMSCs表面分子标志结果显示：CD45-PE低表达，表达率1.65%;CD44-FITC、CD90-APC高表达，表达率分别为94.1%和95.8%(见图2),符合骨髓间充质干细胞典型生物学特征。

图2流式细胞术鉴定体外培养P2代BMSCs的分子表面标志物

a.CD45-PE;b.CD44-FITC;c.CD90-APC。

2.2不同形貌聚乳酸纤维膜的制备、表征及仿生聚乳酸纤维膜的筛选

通过改变电纺参数制备了不同形貌的、纤维直径64～1 311nm变化的聚乳酸纤维膜(见表2),其中分别以电纺参数(5%,18kV,15cm, 1h)、(4.5%,18kV,15cm, 1h)、(5%,18kV,12cm, 2h)制备的直径为：(357±32)nm、(164±13)nm、(1 311±93)nm的纤维膜，三者只在纤维直径大小存在差异，均呈纤维网状结构，纤维粗细均匀，取向相近，易于量化及对比，直径为(357±32)nm的纤维膜在198～365nm区间内，更接近仿生(见图3)。

表2不同电纺参数获得的纤维膜直径值

2.3细胞生长、铺展观察

培养第7天，扫描电镜结果显示：细胞爬附于三种纤维膜及培养板表面生长良好，C组细胞数量少于其他组。A、B二组纤维膜上细胞具有明显聚集区域，细胞相互联系紧密，集落铺展较C、Ctrl二组充分，尺寸较大(见图4)。典型细胞形态观察发现：与其他三组相比，仿生纤维膜A组上，细胞铺展更充分、面积更大、细胞伪足更多， 细胞与纤维之间连接更紧密(见图5)。

2.4细胞黏附情况

在4h, Ctrl组细胞黏附优于C组，差异具有统计学意义(P<0.05),其余各组间差异无统计学意义(P>0.05);在8h和16h, A、B、C三组细胞黏附不如Ctrl组，差异具有统计学意义(P<0.05),A、B组细胞黏附均优于C组，差异具有统计学意义(P<0.05),A、B二组间对比差异无统计学意义(P>0.05),见图6。

图3扫描电镜下各组形貌表征(×4 000)

图4扫描电镜下各组rBMSCs生长、铺展情况(×500)

图5扫描电镜下各组典型细胞形态观察(SEM×2 500)

图6各组rBMSCs的黏附情况

2.5细胞增殖情况

第1天，各组增殖无统计学差异(P>0.05);第3、5天，Ctrl组、A组、B组细胞增殖均优于C组，差异均具有统计学意义(P<0.05),三组间对比，Ctrl组优于A、B二组，差异具有统计学意义(P<0.05),A、B二组间对比，A组高于B组，但差异无统计学意义(P>0.05);在第7、9天，Ctrl、A、B三组细胞增殖均优于C组，差异均具有统计学意义(P<0.05),三组间对比，Ctrl组优于A、B二组，差异具有统计学意义(P<0.05),A、B二组间对比，A组优于B组，差异具有统计学意义(P<0.05),见图7。

图7各组rBMSCs的增殖情况

与Ctrl组相比，*P<0.05;与A组相比，#P<0.05;与B组相比，&P<0.05。

2.6成骨分化基因表达

实时荧光定量PCR结果示：第3、10天A、Positive二组ALP、COLI、Runx2、OSX的mRNA表达量均明显高于B、C、Ctrl三组(P<0.05),A组明显低于Positive组(P<0.05);第3天B、C、Ctrl三组间对比差异无统计学意义(P>0.05);第10天，B组明显高于C、Ctrl二组(P<0.05),C、Ctrl二组间差异无统计学意义(P>0.05),见图8。

2.7成骨分化蛋白表达

Western Blot示：第10天A、Positive二组OPN、OC表达量均明显高于B、C、Ctrl三组，差异均具有统计学意义(P<0.05);A组OC表达量低于Positive组，差异具有统计学意义(P<0.05);B、C、Ctrl三组间差异无统计学意义(P>0.05),见图9。

图8各组成骨分化基因的表达

与A组相比，*P<0.05;与Positive组相比，#P<0.05;与B组相比，△P<0.05。

图9各组OPN和OC蛋白表达水平

与A组相比，*P<0.05;与Positive组相比，#P<0.05。

3、讨论

研究表明材料的特定表面形貌能调控细胞的增殖、形态、迁移及分化等功能活动[9-12]。Watari等[13]以骨内胶原尺寸为参考，制备了深度为300nm,脊槽宽分别为200nm、700nm、2 000nm的脊槽结构聚二甲基硅氧烷基底，发现在胶原纤维尺寸内，脊槽宽为200nm的基底上Runx2和BGP表达量较其他组明显升高，说明脊槽宽为200nm的基底能促进人间充质干细胞成骨分化。以上研究表明以生理状态下特定形貌参数为参考，制备的微观形貌仿生材料更利于细胞完成生物学功能，我们以前期获得的骨基质形貌参数为指导，制备了具有纤维网状结构、纤维直径与胶原纤维尺寸相近的聚乳酸纤维膜，观察其对rBMSCs生物学行为的影响，也发现仿生制备纤维膜能促进rBMSCs黏附、增殖及成骨分化。

纳米形貌表面影响细胞黏附、增殖。本研究发现直径(164±13)nm、(357±32)nm聚乳酸纤维膜上rBMSCs的增殖、黏附优于直径(1 311±93)nm的聚乳酸纤维膜，与Martinez等人[14]认为：尺度更小的纳米形貌表面对细胞功能的影响更为明显的结论相符。分析其可能的原因是前二者纤维膜纤维直径更细、表面比更大，为细胞提供更多的黏着点，利于细胞之间相互作用及物质交换，从而促进细胞黏附、增殖[15-16]。另外本研究还发现三组聚乳酸纤维膜上的细胞黏附、增殖均低于普通培养板，可能由于成品培养板由亲水性聚苯乙烯制作，且表面修饰了氨基等利于细胞黏附基团；聚乳酸亲水性不够理想，影响了细胞黏附，进而影响细胞在材料上生长、增殖[17-18]。

成骨分化基因和蛋白检测结果显示：在直径(1 311±93)nm聚乳酸纤维膜和普通培养板上各时间点均未检测到成骨分化基因蛋白的表达，在直径(357±32)nm的仿生聚乳酸纤维膜上不同时间点成骨分化基因Runx2、COLI、ALP、OSX和蛋白OC、OPN均有明显表达，能肯定仿生制备的直径为(357±32)nm的聚乳酸纤维膜具有良好的成骨诱导能力。另外发现在第10天，直径(164±13)nm的聚乳酸纤维膜上4个基因明显表达而成骨分化蛋白未检测到表达，分析(164±13)nm聚乳酸纤维膜可能也存在成骨诱导能力，弱于直径为(357±32)nm仿生纤维膜，结合mRNA的表达水平，推测可能是形貌因素诱导的时间还未达到转录后的蛋白翻译水平，故未检测到蛋白的表达。

扫描电镜结果显示：三种形貌聚乳酸纤维膜和普通培养板上，细胞铺展面积、形态各不相同。研究发现：材料表面微纳形貌可通过改变细胞整合素的聚集和黏着斑的装配，从而影响细胞自身微丝骨架的排列，最终导致细胞形态变化。而整合素可以通过黏着斑将细胞外机械信号转换为生化信号从而影响细胞的迁移、生长和分化，另外，形貌变化，会触发细胞黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)活化、启动其下游信号转导途径，使得相应信号分子胞内运输和受体配体结合强度等改变，进而调控细胞的增殖、分化[19-22]。

McBeath等人[23]研究发现，MSCs铺展情况与其分化方向相关，不完全铺展呈现圆形的MSCs容易向脂肪细胞分化，而充分黏附、平铺伸展的MSCs则有更大的成骨分化倾向，这是由于MSCs形态的改变影响了Rho家族三磷酸鸟苷(guanosinetriphosphate, GTP)酶的活性，RhoA·Rock信号通路可能通过细胞黏着斑转导，MSCs形态变化将改变RhoA介导的细胞骨架的重排、黏着斑的装配及整合素介导的下游信号通路，从而影响MSCs的生物学行为[24-25]。本研究发现，与其他组相比，rBMSCs在(357±32)nm膜上铺展更充分，面积更大，伪足更多，细胞与纤维间结合更紧密，因此推测纤维直径为(357±32)nm的仿生纤维膜，能够更好地为rBMSCs提供黏附位点，使得rBMSCs整合素的聚集和黏着斑的装配的作用更强，从而使细胞铺展更充分，面积更大，跟其他组在形态学上有明显的差异，结合成骨分化基因和蛋白明显升高结果，推测纤维膜上细胞形态的改变，使RhoA介导的细胞骨架的重排、黏着斑的装配及整合素介导的下游信号通路被激活，从而调控rBMSCs成骨分化。

形貌因素诱导BMSCs成骨分化分子机制并不明确，成骨分化相关信号通路如：MAPK/ERK、Wnt、BMP/Smad等激活会导致下游的目的基因Runx2、OSX发生转录，进而表达成骨特异分子如骨钙素、骨桥蛋白、骨涎蛋白等。本研究发现直径(357±32)nm的仿生纤维膜上成骨分化基因Runx2、OSX的mRNA和OC、OPN表达水平明显高于其他组。因此，推测微观形貌可能激活了MAPK/ERK、Wnt、BMP/Smad信号通路导致下游基因Runx2、OSX上调，进而促进BMSCs成骨分化。当然，这有待进一步通过分子生物学手段(如：转录组测序、GO聚类分析等),验证形貌因素诱导骨髓间充质干细胞成骨分化信号通路及潜在的分子机制。

本研究存在以下不足：首先，骨组织样本表征，取样种类、部位单一，微观形貌表征的尚不充分，后期可扩大对不同部位、年龄、性别、骨状态下等骨组织样本的表征，得到更合理的形貌参数。其次，纤维膜在纳米尺度存在仿生，但并不具备真正意义上的空间三维结构，可结合3D打印，表面修饰等技术制备出宏观—毫米—微米—纳米梯度仿生具有更佳骨诱导、骨传导的支架材料。

本研究发现与非仿生纤维膜相比，直径为(357±32)nm的仿生纤维膜能促进大鼠BMSCs黏附、增殖、成骨分化。本研究结果补充了以往以生物化学为主导的干细胞分化理论，也初步筛选、获得了间充质干细胞成骨分化的微观形貌范围，以期能指导现有成熟的骨替代材料的微观形貌设计，提升改进后骨替代材料的骨诱导能力，为骨组织工程修复材料微观形貌设计提供理论依据，也为进一步明确仿生微观形貌诱导BMSCs成骨分化关键信号通路、蛋白的调节等分子机制的研究奠定了一定基础。

参考文献:

[2]魏晨旭,何怡文,王聃,等.组织工程学中骨修复材料的研究热点与进展[J].中国组织工程研究,2020,24(10):1615-1621.

[5]孙现娟,王秋花,张锦艺,等.不同静电纺丝膜上骨髓间充质干细胞的黏附､增殖与成血管平滑肌分化[J].中国组织工程研究,2024,3(13):9.

[6]刘洋,韩东,何飞,等.基底硬度与形貌协同对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[J].医用生物力学,2016(3):218-226.

[9]段浩.仿生骨组织不同层级形貌结构的支架材料制备及其对BMSC的影响[D].昆明:昆明医科大学,2020.

[11]刘政.基于骨表面微观形貌参数nHA/PLA纤维膜制备及对rBMSCs成骨分化的影响[D].昆明:昆明医科大学,2020.

[15]吕文波.杂化碳纳米纤维仿生骨材料的制备及生物相容性研究[D].保定:河北大学,2021.

[16]刘子杨,劳安,徐陈词,等.聚己内酯-聚多巴胺-AOPDM1支架在高糖环境下的促成骨性能[J].中国组织工程研究,2024,28(17):2667-2674.

[17]顾张弘,姚响,王锦思,等.具有细胞黏附反差特性的单层平行丝素蛋白纤维图案的制备及其性能[J].纺织学报,2022,43(5):1-6.

[19]王灿灿,陈乐乐,李正逗,等,聚乳酸/高乌甲素复合微/纳米纤维膜的制备及性能研究[J].合成纤维工业,2023,46(4):6.

[21]樊广辉,等.微图案纳米纤维膜通过调控LncRNA-XIST/miR-150-5p/COL1A1通路促进伤口愈合[D].济南:山东大学,2024.

[22]李狱,双剑博,吴楠,等.载药可降解聚乳酸纤维膜在大鼠腹腔术后肠粘连的预防效果及对TGF-β1和CollagenⅠ的影响[J].现代生物医学进展,2024,38(2):7-13.

文章来源:陈林,王明俊,孙锦波,等.仿生聚乳酸纤维膜对大鼠BMSCs成骨分化的影响[J].医学理论与实践,2024,37(20):3421-3426+3450.