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急性脑血管疾病铜绿假单胞菌感染现状及相关疫苗研究进展

2024-07-12 45 上传者：管理员

摘要：铜绿假单胞菌是院内感染的主要病原菌，其易发展成多重耐药菌和泛耐药菌。而急性脑血管疾病患者身体虚弱，一旦感染铜绿假单胞菌将会导致治疗棘手。铜绿假单胞菌的耐药机制较复杂，包括抗生素作用靶点改变、质粒介导、生物膜形成、外排机制和膜通透性改变等。研究铜绿假单胞菌的耐药机制，有利于铜绿假单胞菌感染的治疗。铜绿假单胞菌有多种毒力因子，其中的Ⅲ型分泌系统和Ⅵ型分泌系统在铜绿假单胞菌感染中发挥着重要作用。铜绿假单胞菌的疫苗研究一直备受关注，为预防铜绿假单胞菌感染提供了新的手段。

关键词：
分泌系统
疫苗研究
绿脓杆菌
耐药机制
铜绿假单胞菌
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铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)又称绿脓杆菌,属于假单胞菌科的革兰阴性菌,1882年于伤口脓液中首次分离得到[1]。菌体有1-3根鞭毛,无芽胞,能形成荚膜。PA具有较强的生存能力,它能够在4～50℃条件下存活,广泛存在于自然界,如土壤、水、动物和植物等,尤其适应于潮湿的环境[2]。PA可以摄取有机物质作为食物,不需要特殊的培养条件。它能够感染导致莴苣等导致软腐病,也能使果蝇等致病。PA是人类重要的条件致病菌,也是是医院内感染的重要病原体之一,它能够存活在医院的环境中,如器械表面、人体组织、病房设施中等[3]。2021年CHINET中国细菌耐药监测显示PA占总检出菌株数量的7.96%,其中PA占不发酵糖革兰阴性杆菌的34.9%[4]。免疫力低下患者、术后患者、烧伤患者、长期卧床患者、囊性纤维化患者、机械通气患者易由PA引发感染[5]。PA具有多种毒力因子和胞毒素,这些毒力因子可以帮助PA在人体定植和引发持续性感染。分泌系统是PA的重要组成部分,PA可以通过分泌系统获取所需的营养,并且向外分泌毒素发挥其致病性。其中有研究显示Ⅲ型分泌系统(typeIII secretionsystem,T3SS)与临床严重感染有关,Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretionsystem,T6SS)其分泌的效应蛋白,有较强的毒力效应[6]。随着抗生素的广泛使用,PA对多种抗生素产生了不同程度的耐药性,出现了多耐药和反耐药PA菌株,这使得治疗更加棘手。本文对急性脑血管疾病PA感染现状,PA的耐药机制、分泌系统和疫苗研发进行概述。

1、急性脑血管疾病PA感染

急性脑血管疾病由脑血栓形成、血栓栓塞、脑实质血管破裂等多种原因造成的一类发病急骤的脑部血流循环障碍疾病。因而,它大致可以分为梗塞性和出血性两大类。急性脑血管疾病临床体现为起病急骤,出现失语、共济失调、瘫痪、眩晕和意识障碍等临床症状,流行病学调查显示它已成为三大人类致死原因之一[7]。随着生活质量和人均寿命的提高,高血压、高血脂、动脉粥样硬化和心房颤动的发病率呈上升趋势,从而导致心脑血管疾病发病率随之上升。急性脑血管疾病可引起院内感染、误吸、心律失常、压疮和消化道出血等并发症。其中院内感染是急性心脑血管疾病患者住院期间的常见并发症,进一步加大了患者死亡风险,也影响了患者的康复。而肺部和呼吸道感染在急性脑血管疾病患者感染中占比较高,其次是泌尿系感染和消化道感染等。冯社军等[8,9]研究显示青少年急性脑血管疾病患者医院获得性肺炎中以革兰阳性菌为主,中老年以革兰阴性菌为主,而其中铜绿假单胞菌是主要致病菌,这也国内其他研究相一致。

2、PA耐药机制

病原菌引发的感染在治疗上以抗生素为主要手段,但是随着抗生素的广泛应用,出现了多耐药和反耐药PA菌株。PA的耐药机制较为复杂,常见的有天然耐药,抗生素作用靶点改变、质粒介导、生物膜形成、外排机制和膜通透性改变等。PA对氨苄西林,阿莫西林、青霉素类、一代头孢菌素(头孢噻吩,头孢唑啉),二代头孢菌素(头孢呋辛),头孢霉素类(头孢西丁、头孢替坦),克林霉素,达托霉素,夫西地酸,糖肽类(万古霉素、替考拉宁),利奈唑胺,大环内酯类(红霉素、阿奇霉素、克拉霉素),奎奴普汀-达福普汀,利福平存在天然耐药[10]。氨基糖苷类抗生素曾对PA具有较高的治疗效果,在治疗PA感染中发挥着重要作用,并曾作为一线用药广泛使用。近年来PA对氨基糖苷类抗生素产生耐药的现象不断被报道。氨基糖苷类抗生素因其分子结构都有一个氨基环醇类和一个或多个氨基糖分子。它们能够作用于细菌体内的核糖体,抑制蛋白质的合成,并破坏细菌细胞膜的完整性。PA对氨基糖苷类抗生素产生耐药性,主要机制是钝化酶的产生。氨基糖苷修饰酶通过作用于特定的羟基或氨基,使氨基糖苷类抗菌药物发生钝化。如氨基糖苷乙酰基转移酶(AAC)、氨基糖苷磷酸化转移酶(APH)和氨基糖苷核苷酸转移酶(ANT)。它们广泛存在于PA多重耐药菌和泛耐药菌中。AAC有4种同工酶,乙酰辅酶A是它们乙酰基的供体,分别为:AAC(1)、AAC(3)、AAC(2')和AAC(6')。它们作用位点分别为:氨基糖苷类抗生素的2-脱氧链霉胺环的1位和3位,氨基己糖环的2'位和6'位上游离的氨基[11]。APH由多个具有不同功能的亚基组成,它能够使磷酸基团从腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)或其他磷酸供体转移出来,并与氨基糖苷类抗生素相结合,改变药物结构,从而使得抗生素失效。ANT是一种能够将氨基糖苷类抗生素从细菌细胞中排出的酶,从而降低细菌对氨基糖苷类抗生素的敏感性。氨基糖苷类药物结合在细菌30S核糖体亚基位的16Sr RNA的A位点中的基因,从而影响核糖体功能使得蛋白质合成过程移位抑制和转录错误,从而实现对细菌灭活。16Sr RNA甲基化酶可以使药物作用靶位甲基化,从而与氨基糖苷类药物亲和力下降,导致PA对临床常用氨基糖苷类抗生素高度耐药[12]。β-内酰胺酶能够使β-内酰胺环裂解从而使β-内酰胺抗生素失效。其中金属β-内酰胺酶的活性部分是由金属离子构成,它可以水解包括碳青霉素类的所有β-内酰胺酶抗生素。金属β-内酰胺酶可以借助在质粒、转座子和整合子在不通PA菌株间传播。PA菌株常见的金属β-内酰胺酶有:VIM型、IMP型、AIM型、GIM型和SPM型等。整合子是DNA结构组织,位于细菌细胞膜、细胞质或细胞核上的遗传物质。它是一种细菌耐药基因水平传播机制。目前已发现的转座子约有10种类型,其中5种类型与抗生素耐药性的基因盒,可携带约70种耐药基因。外膜通透性与PA耐药性具有一定关系,有研究显示亚胺培南与PA的青霉素结合蛋白结合需要通过外膜孔蛋白Opr D特异性介导,否则亚胺培南无法发挥抑菌作用。有研究显示对亚胺培南耐药且无Opr D蛋白表达的PA转导Opr D的质粒后,PA再次表达Opr D蛋白,其对亚胺培南敏感[13]。因而Opr D基因的突变、插入和/或缺失都是引起PA对碳青霉烯类抗生素耐药。生物被膜是细菌及其分泌胞外多糖等物质形成高度组织化、结构化膜状细菌群体,附着在腔道或上皮细胞表面而形成的一种复合物。它可以保护细菌不被宿主机体免疫系统和抗生素侵害,它对抗生素的耐受性比其浮游菌显著提高。而由PA引起的慢性感染与它的生物膜的形成有关。进一步研究显示由于蛋白质合成主要场所是核糖体,核糖体、氨基酸、蛋白质与铜绿假单胞菌生物被膜形成、发展密切相关[14]。外排泵系统又可称为又称药物主动转运系统,PA中被发现的外排泵主要为抗药小结分裂区(Resistancenodulationdivision,RND)家族和主要促进剂超家族(Majorfacitatorsuper,MFS),它们由细菌染色体编码。RND家族外排泵由三种成分组成分别为:OM通道形成蛋白(OM因子/OMF)、内膜药物质子逆向转运载体(RND成分)和周质连接蛋白。外排泵通过改变外膜(Outermembrane,OM)通透性并能够将抗生素外排一种机制。PA细胞膜可以将抗生素渗透到OM中使抗生素有效外流,从而保护PA免受抗生素伤害。若突变体缺乏OM蛋白则会使PA对抗生素过敏[15]。mex XY操纵子有2个开放阅读窗分别为mex X和mex Y,它们编码膜融合蛋白Mex X和RND转运子Mex Y。Mex X位于菌细胞的周浆间隙,诱导或稳定外膜蛋白的开放状态,可以将Mex Y识别的药物直接排出。Mex Y位于细菌细胞膜上,能够识别并结合外排底物。Mex XY外排泵能够通过外排胞内药物介导PA天然耐药和获得性耐药。诱导Mex XY高表达,PA可外排氨基糖苷类、两性离子型头孢菌素、氯霉素、氟喹诺酮类、大环内酯类、四环素类等抗生素。编码基因mex Z编码Mex Z蛋白,位于mex XY操纵子上游。Mex Z蛋白能够直接抑制mex XY转录或进入启动子结合点阻止mex XY转录,因而mex Z是mex XY的转录抑制因子[16]。当编码基因mex Z突变,Mex Z结合DNA能力下降时,Mex XY表达水平增加。有研究显示敲除了Mex Z的突变株Mex XY表达水平增加,另一项研究显示Mex XY高表达的PA菌株中缺乏Mex Z[17]。

3、PA分泌系统

PA的致病力与其分泌系统分泌的多种毒力因子有关,这些毒力因子在PA定植和感染过程中发挥着至关重要的作用。T3SS分泌效应蛋白可以向宿主内部输入毒性效应蛋白,它们可以破坏细胞信号通路,引起肌动蛋白细胞骨架重排、从而细胞凋亡,是导致宿主损伤的重要因素。T3SS分泌效应蛋白能够进入细胞,降低宿主免疫力并引起细胞凋亡。它包含exo S、exo T、exo U和exo Y等毒力基因,这些毒力基因可以编码Exo S、Exo T、Exo U和Exo Y等效应蛋白。Exo S能够参与宿主免疫调节能抑制宿主细胞吞噬作用,而Exo U则是主要毒性蛋白能够引起细胞凋亡。当Exo S表达增加时,其他菌减少,PA成为主要致病菌。Exo U的早期表达与PA的感染严重程度有关,当Exo U表达上调,则感染更加严重。因而,exo U基因阳性的PA菌株感染患者一般情况下,PA感染比较严重。有研究显示PA感染者分离出的菌株与环境中的exo U的基因携带情况具有显著差异[18]。曾有研究认为exo S基因与exo U基因不能存在于同一菌株中,观点是位于细菌染色体同一位点;而另有研究认为exo U基因位于染色体基因岛上,exo S基因则位于其他位置。越来越多研究表明,exo U基因和exo S基因与PA菌株耐药存在一定关系。exo U基因和exo S基因的PA菌株有:exo U+/exo S+,exo U+/exo S-,exo U-/exo S+和exo U-/exo S-四种组合形式。其不同组合形式PA耐药情况存在一定差异[19]。PA的T6SS分泌效应蛋白能够向邻近的细菌传递毒素和蛋白效应因子,使它在细菌间竞争中起主要作用。它还能促进其生物被膜的形成,从而使PA在耐药性上发挥着重要作用。有研究显示T6SS基因群中的pld A基因编码的磷脂酶A(Pld A)能够向宿主细胞传递毒素[20]。

4、PA疫苗

PA多耐药菌和泛耐药菌的出现使得治疗越来越棘手,因而研发PA疫苗是解决这一治疗困境有效手段[21,22,23,24]。截至目前约有60种疫苗处于研发中,疫苗靶点包括胞外多糖(extracellularpolysaccharide,EPS)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、鞭毛、外膜蛋白(outermembrane protein,OMP)、细菌毒素、外膜囊泡(outermembranevesicle,OMV)等,根据技术路线不同可分为组分疫苗、全菌体灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗[25]。PA的的EPS结构简单且分子结构相对保守,感染者能够产生特异性抗体。将PA藻酸盐与一些载体蛋白连接制成的EPS疫苗在兔体内产生更高水平的抗藻酸盐抗体。LPS是PA细胞膜外的主要成分脂质A(lipidA)、核心寡糖(coreoligosaccharide)和O-抗原(O-antigen)构成。O-抗原是区分细菌血清型的主要结构成分,依据O-抗原将分为20个血清型。而单一血清型疫苗只能预防该血清型的PA感染。鞭毛是PA运动的主要器官,可作为抗原。在小鼠实验中,大肠埃希菌表达纯化重组鞭毛蛋白Fli C与ETA后制备的重组蛋白可提高体液免疫及细胞免疫水平。T3SS分泌效应蛋白中的Pop B/Pop D能够在宿主细胞上形成孔道,向宿主释放毒力因子,而将OMP与T3SS分泌效应蛋白的靶点蛋白联用设计疫苗,可获得较高的保护力。

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基金资助:首都卫生发展科研专项基金(No.2020-1-2241);

文章来源:张菁,武剑.急性脑血管疾病铜绿假单胞菌感染现状及相关疫苗研究进展[J].中国病原生物学杂志,2024,19(07):867-869.