石榴(Punica granatum L.)属于落叶灌木类果树，果实为浆果类[1],果实含有丰富的维生素C,具有较高营养价值，受到广大中国消费者的青睐[2]。但目前中国繁殖石榴苗的方式较为单一，采用的繁殖方式主要为扦插繁殖[3]和组织培养繁殖。因此，建立快速繁殖无病毒的石榴组培苗技术已成为石榴发展行业需要攻克的重要问题之一。

在植物组织培养中，碳源不仅为植物提供生长所需的能量，而且是植物调节渗透环境的主要物质[4]。此外，在初期组培苗幼芽生长、形态建成以及叶片进行光合作用都需要碳源。在常规石榴组织培养繁殖主要的碳源以蔗糖为主，而糖用量不足或长时间不转移组培苗会使蔗糖耗尽，从而引起组培苗的黄化现象，并且影响初代培养的成活率以及增殖系数等[5]。

无糖组织培养技术作为一种新的植物微繁殖技术，是以CO2代替糖作为植物体的唯一碳源[6],通过输入CO2气体作为碳源，并采用微环境控制技术影响组培苗生长发育的环境因子，通过自然或强制性换气系统供给植株生长所需的CO2,提供适宜植株生长的温度、湿度、光照、气体、营养等条件，促进植株光合作用，使组培苗由兼养型转变为自养型，进而生产出优质种苗[7]。无糖组织培养技术，在一定程度上避免了微生物的污染，提高了移栽成活率，更利于工厂化育苗成本的降低，便于新技术的推广[8]。目前，无糖组织培养已应用到甘蔗[9]、苹果、茶树[10]、楸树[11]等作物中，但未查阅到石榴无糖组织培养的相关文献，关于石榴无糖组织培养体系有待建立。

本研究以组织培养15 d、带有5片及以上叶片生长良好的石榴组织苗为材料，采用蛭石为基质进行无糖组织培养，对无糖组织生长调节剂的浓度、不同光质以及不同基质含水量进行系统化的筛选，从而建立适用于石榴组培苗无糖组织培养的生长条件，为工厂化育苗奠定基础。

1、材料与方法

1.1 试验材料

试验材料由安徽科技学院农学院园艺植物组织培养室提供，以常规组织培养15 d、带有5片及以上叶片生长良好的石榴组织苗为试验材料。石榴常规组织培养为MS+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖[12]。

1.2 培养条件

培养室温度为(25±2) ℃,光照时间为12 h/d, 光照强度为3 000 lx, 相对湿度为50%～60%。

1.3 试验方法

1.3.1 不同基质含水量在无糖组织培养条件下对石榴组培苗生长的影响

本试验选用常规组织培养15 d、带有5片及以上叶片且生长良好的石榴组培苗为材料，以20 g蛭石为基本培养基质，分别加入10、12、14、16 mL含有0.8 mg/L IBA的WPM溶液，使其基质含水量为50%(S1)、60%(S2)、70%(S3)、80%(S4),调节pH为5.8,高压灭菌锅内121 ℃灭菌20 min。并以常规组织培养为对照(CK)。每个处理4重复，每瓶接种4株，共16株。采用白光作为光源，在培养室内培养30 d, 统计无糖组培苗的株高、根数和根长，计算生根率、平均株高、平均根长，进行方差分析。并进行移栽，统计成活率，筛选出最适宜石榴组培苗生长的基质含水量。

1.3.2 不同光质在无糖组织培养条件下对石榴组培苗生长的影响

选用常规组织培养15 d、带有5片及以上叶片且生长良好的石榴组培苗为材料，以20 g蛭石为基本培养基质，在蛭石中加入14 mL含有0.8 mg/L IBA的WPM溶液使基质含水量为70%,调节pH为5.8,高压灭菌锅内121 ℃灭菌20 min。本研究共设置4种不同光质，分别是白光(B)、红光(H)、红蓝光(HL)、蓝光(L)。每个处理4个重复，每瓶接种4株，在培养室内培养30 d, 统计无糖组培苗的株高、根数和根长，计算生根率、平均株高、平均根长，进行方差分析。并进行移栽，统计成活率，筛选出最适宜石榴组培苗生长的光质。

1.3.3 不同浓度IBA在无糖组织培养条件下对石榴组培苗生长的影响

选用常规组织培养15 d、带有5片及以上叶片且生长良好的石榴组培苗为材料。在蛭石中加入14 mL含有不同浓度IBA的WPM溶液使基质含水量为70%,调节pH为5.8,高压灭菌锅内121 ℃灭菌20 min。本研究设置6种不同质量浓度的IBA(表1),每个处理4个重复，每瓶接种4株，采用白光作为光源，在培养室内培养30 d, 统计无糖组培苗的株高、根数和根长，计算生根率、平均株高、平均根长，进行方差分析。并进行移栽，统计成活率，筛选出最适宜石榴组培苗生根的IBA质量浓度。

表1 无糖组织培养不同IBA质量浓度处理

2、结果与分析

2.1 不同基质含水量在无糖组织培养条件下对石榴组培苗生长的影响

由表2可以看出，不同基质含水量在无糖组织培养条件下对石榴组培苗生长有不同的影响，常规组织培养(CK)的组培苗株高为(6.14±1.03) cm, 比无糖组织培养的组培苗高3倍左右，二者之间存在显著差异。不同基质含水量在无糖组织培养条件下对石榴组培苗株高的影响由高至低依次为S4>S2>S3>S1,且各处理株高之间差异不显著。不同基质含水量在无糖组织培养条件下对石榴组培苗地下部指标也存在影响，生根率由大到小依次为CK>S4>S2=S3>S1,CK的生根率高达100%,CK与S4、S2、S3差异不显著，CK、S4、S2、S3与W1差异显著；平均生根数由多到少依次为CK>S4>S2>S3>S1,CK与其他处理组差异显著，S4、S2、S3与S1差异显著；根长由长到短依次为S4>S3>S2>S1>CK,S4与S3差异不显著，S4与其他处理组差异显著。

表2 不同基质含水量在无糖组织培养条件下对石榴组培苗生长状态的影响

每组处理在培养室内培养30 d后进行移栽，不同处理移栽后的成活率也有很大的差异。由图1可以看出，S4移栽成活率最高(89.25%±1.25%),其他处理组移栽成活率均低于70%,S4与其他处理组差异显著。由图2可以看出，CK处理下的石榴组培苗地上部分生长良好，但地下部分不发达；S1处理下，石榴组培苗出现了大面积的黄褐现象，是由于严重失水造成的；S2处理下，石榴组培苗叶片边缘出现了轻微的枯焦现象；S3和S4的处理下，石榴组培苗生长较为良好，且地下部分根系发达。

综上，石榴无糖组织培养的基质含水量在80%为最适宜，其株高与根系生长量都能达到生长的要求，且移栽成活率高达89.25%。

2.2 不同光质在无糖组织培养条件下对石榴组培苗生长的影响

由表3可以看出，常规石榴组织培养是在培养室的白质光下培养，本研究将石榴组培苗放置于培养室的不同光质下培养，表现出不同的效果。不同光质在无糖组织培养条件下对4种石榴组培苗株高的影响由高到低依次为H>HL>L>B,4种处理的株高之间没有显著差异，其中株高最高的是H,为(2.14±0.21) cm, 最低的是B,为(1.80±0.07) cm。不同光质在无糖组织培养条件下对石榴组培苗地下部分也有不同的影响，其中对生根率的影响从高到低依次为H>B>L=HL,在这4组处理中H的生根率为100%,但与其他处理相比差异不显著；4种处理中的生根数由多至少依次为H>HL>B>L,处理组H与处理组L差异显著；对不同光质对石榴组培苗根长的影响从高到低依次为B>HL>H>L,4种处理根长差异均不显著。

图1 不同基质含水量在无糖组织培养条件下对石榴组培苗移栽成活率的影响   

图2 不同基质含水量条件下石榴组培苗无糖组织培养的生长状况   

表3 不同光质在无糖组织培养条件下对石榴组培苗生长状态的影响

每组处理在培养室内培养30 d后进行移栽，不同光质处理移栽后的成活率也有很大的差异。由图3可以看出，4种不同光质处理移栽后的成活率由高到底依次为B>H>HL>L,处理组B与H差异不显著，B和H与其他两个处理差异显著。处理组B和H成活率在80%以上，处理组L和HL成活率在70%以下。由图4可以看出，B和H处理下，石榴组培苗的根系较健壮发达；L处理下，石榴组培苗的须根生长不发达，且伴随着叶片边缘出现轻微的枯焦现象；而在HL处理下，石榴组培苗的叶片较小并出现卷曲现象。因此，可以发现，白光以及红光都可以满足无糖石榴苗组织培养的正常生理要求，而同等光照强度下的红蓝光以及蓝光并不适用于石榴苗的无糖组织培养。

综上，在石榴无糖组织培养中，红光和白光均有利于石榴组培苗的生长，移栽后成活率均能达到89.75%。

图3 不同光质在无糖组织培养条件下对石榴组培苗移栽成活率的影响  

图4 不同光质条件下石榴组培苗无糖组织培养的生长状况  

2.3 不同IBA浓度在无糖组织培养条件下对石榴组培苗生长的影响

由表4可以看出，本研究采用不同浓度IBA在无糖培养条件下对石榴组培苗进行生根诱导。其中不同IBA浓度对石榴组培苗株高的影响，从高到低依次为A4>A3>A2>A5>A6>A1,其中A2、A3与A4处理与其他处理相比差异显著，A1、A2、A5与A6处理间差异不显著。不同IBA浓度对地下部分也有不同的影响，在生根率指标中，A5和A6处理的生根率达到80%以上，与A1、A4处理组差异显著；在生根数指标中，生根数由多至少依次为A6>A5>A4>A3>A2>A1,其中的A5、A6处理要明显高于其他处理，并与其他处理组差异显著；在根长指标中，其中A1处理要明显比其他处理低，其余5种处理的数值处在相近的水平。

表4 不同IBA浓度在无糖组织培养条件下对石榴组培苗生长状态的影响

每组处理在培养室内培养30 d后进行移栽，不同IBA浓度处理移栽后的成活率也有很大的差异。由图5可以看出，成活率由高至低依次为A5>A6>A4>A3>A2>A1,A5与A6差异不显著，A5和A6与其他处理组之间差异显著。由图6可以看出，A1、A2和A3处理与其他处理相比其根系生长并不发达，且叶面出现了大面积的黄褐现象；A5和A6的处理下，石榴组培苗叶片生长较为良好，且地下部分根系发达。

综上,0.8～1.0mg/LIBA在石榴组培苗无糖培养中使用最为恰当,不但有利于地下部分的生长,且移栽后成活率均能达到89%。

图5 不同浓度IBA在无糖组织培养条件下对石榴组培苗移栽成活率的影响  

图6 不同浓度IBA条件下石榴组培苗无糖组织培养的生长状况  

3、结论与讨论

环境因子中，水分和光照对植物生长尤为重要，基质含水量影响果实产量和品质，植物细胞内的物质运输、新陈代谢等过程也都离不开水，因此，适当的水分管理对植物的生长尤为重要[13]。目前不同波长的光质在植物培养过程中应用越来越广泛[14],光质对植物形态发生、光形态建成、生长控制、代谢物含量的影响及各种反应机制的研究也越来越深入[15]。生长素对器官的建成作用最为明显，其中最明显的是促进根原基的形成及生长，而IBA在生长素中促进生根的效果最好[16]。

本研究主要验证了无糖组织培养在石榴组培苗上的可行性，以常规组织培养15 d、带有5片及以上叶片生长良好的石榴组织苗为材料，建立适用于石榴组培苗无糖组织培养的生长条件。基质含水量为80%最适宜石榴无糖组织培养；石榴无糖组织培养在红光和白光下均有利于组培苗的生长，与季亚萍[17]研究结果相同；IBA质量浓度为0.8～1.0 mg/L在石榴组培苗无糖培养中使用最为恰当，与牛娟等[18]研究结果相同。在生长调节剂浓度、光质、基质含水量均适宜的条件下，生长优质的石榴苗，减少驯化时间，缩短育苗周期，提高移栽成活率，降低种苗的生产成本以及时间，提高了生产的效率。

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基金资助:安徽省高校自然科学研究项目(KJ2021A0900);石榴种质库资源建立(AKZY2022110);安徽省大学生创新创业训练计划项目(S2021c0879221);

文章来源:戴含晶,陈金鑫,王宁等.石榴组培苗无糖培养条件的初步研究[J].安徽科技学院学报,2023,37(06):35-40.